楊永剛， 張梅， 胡耀中， 趙雨， 趙大慶， 幺寶金*

(1. 長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春130117； 2. 長春中醫(yī)藥大學創(chuàng)新實踐中心，長春130117；3.長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，長春130117)

鹿茸為鹿科Cervidae動物梅花鹿Cervusnippon或馬鹿Cervuselaphus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，為傳統(tǒng)名貴藥材，具有壯腎陽、益精血和強筋骨等功效(國家藥典委員會，2015)。鹿茸具有循環(huán)再生和快速生長兩大特點，其生長機制一直是研究熱點?？焖偕L期的鹿茸每天可增加2 cm，伴隨著骨化程度的不斷加深和最終茸皮的脫落，進而形成徹底鈣化的鹿角(Li，2012；Chuetal.，2017)。鹿茸的生長主要由鹿茸頂端的生長中心調(diào)控，在結(jié)構(gòu)上主要劃分為茸皮、間充質(zhì)和軟骨組織等(Lietal.，2002)。茸皮與鹿茸其他部位的皮膚不同，主要表現(xiàn)為表皮層較厚、皮脂腺較大、立毛肌和汗腺缺失、毛囊組織存在不同發(fā)育階段及無疤痕性損傷修復(fù)等(Li & Suttie，2000；Li，2010)。但有關(guān)茸皮在鹿茸生長發(fā)育過程中的基因表達變化的研究仍然幾近空白。因此，研究不同生長時期鹿茸生長中心茸皮的基因表達變化，對于揭示鹿茸再生及快速生長機制具有重要意義。同時，對于皮膚、軟骨及骨組織損傷修復(fù)及相關(guān)疾病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。

近年來，高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展促使生物學領(lǐng)域的研究手段發(fā)生了重大的變革，尤其是以基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學為代表的技術(shù)在科學研究中發(fā)揮著巨大作用(Bourgardetal.，2018)。其中，轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)更是在基因表達分析研究方面起著重要作用(Hrdlickovaetal.，2017)。RNA-Seq技術(shù)具有通量高、靈敏度高和成本低等特點，與基因芯片和傳統(tǒng)測序方法相比，可以對基因表達變化進行系統(tǒng)研究，進而對組織或細胞在某種生理和病理條件下的生物學機制進行較為全面的分析和詮釋。同時，RNA-Seq除了可以對模式生物進行轉(zhuǎn)錄組測序，還可以對無參考基因組的非模式生物進行從頭測序(Costa-Silvaetal.，2017；Sudhagaetal.，2018)。本研究采用RNA-Seq技術(shù)對快速生長期和骨化期梅花鹿鹿茸生長中心的茸皮進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，通過生物信息學分析方法對測序結(jié)果進行組裝和拼接，篩選不同生長時期茸皮中的差異表達基因，這些研究結(jié)果對于揭示鹿茸生長機制及組織損傷修復(fù)研究具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性梅花鹿東北亞種Cervusnipponhortulorum(吉林省雙陽鹿鄉(xiāng))；DEPC-treated Water(AM9916，Thermo)；TRIzol Reagent(15596018，Thermo)；氯仿(B0102004，北京化工)；異丙醇(B0301007，北京化工)；無水乙醇(B0301002，北京化工)；TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit(RS-122-2101，Illumina)。

1.2 方法

1.2.1 不同生長時期鹿茸生長中心茸皮組織采集選取健康的4周歲雄性梅花鹿6只，分別于快速生長期(生茸后60 d)和骨化期(生茸后90 d)采集兩側(cè)鹿茸生長中心組織(距離茸尖5 cm)。按照Li等(2002)的實驗方法分離鹿茸茸皮，置于純化水中反復(fù)漂洗去除血液，切成小塊后置于液氮罐中凍存。

1.2.2 總RNA提取制備及測序文庫構(gòu)建采用TRIzol(Invitrogen，USA)法從鹿茸生長中心茸皮中提取總RNA，通過Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(Agilent Technologies，USA)考察RNA完整性。采用TruSeq Stranded mRNA試劑盒(Illumina，USA)進行測序文庫構(gòu)建：首先，采用帶有Oligo(dT)的偶聯(lián)磁珠(Life Technologies，USA)從總RNA中純化富集mRNA，并進行mRNA片段化；以片段化的mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物合成雙鏈cDNA并經(jīng)核糖核酸酶處理降解mRNA；最后，經(jīng)末端修復(fù)和接頭連接后，通過PCR擴增獲得最終的測序文庫。

1.2.3 文庫測序和差異基因表達分析文庫測序在Illumina Hiseq 2000平臺(Illumina，USA)上進行，測序結(jié)果采用Illumina HCS 1.1進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和質(zhì)量評價。去除載體序列和低質(zhì)量序列(堿基質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整個reads的20%以上)，獲得clean reads，并采用Trinity(Grabherretal.，2011)進行序列從頭組裝。組裝數(shù)據(jù)通過BLASTX比對程序與nr(Non-redundant)和Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫比對，進行基因注釋，以E<10-5為評價標準?；虮磉_量分析采用FPKM法(Trapnelletal.，2010)進行計算，差異基因表達分析通過DEGseq(Wangetal.，2010)進行分析，差異表達基因判定標準為：快速生長期和骨化期茸皮組織差異基因表達倍數(shù)在2倍以上[即log2(Fold change)≥1或≤-1，F(xiàn)old change=骨化期FPKM/快速生長期FPKM]，且假發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.001。

1.2.4 功能分類及代謝通路富集分析針對篩選出的差異表達基因，通過Blast2GO比對到GO數(shù)據(jù)庫(http：//www.geneontology.org/)進行功能分類富集分析，通過KOBAS比對到KEGG數(shù)據(jù)庫(http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html)進行代謝通路富集分析，采用Fisher檢驗和FDR校正獲得Q<0.05的功能條目或代謝通路判定為顯著性富集。

2 結(jié)果

2.1 測序和組裝

通過高通量RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序，分別從快速生長期和骨化期鹿茸生長中心茸皮中獲得4.42 Gb和4.45 Gb的測序數(shù)據(jù)。其中，測序raw reads分別為45 422 254條(快速生長期)和45 421 562條(骨化期)，去除載體序列和低質(zhì)量序列后，分別獲得44 199 056條(快速生長期)和44 530 430條(骨化期)clean reads，測序質(zhì)量值(Q20值)分別為98.50(快速生長期)和98.39(骨化期)。通過Trinity組裝，分別獲得44 352條(快速生長期)和43 194條(骨化期)組裝序列(Unigenes)，平均長度分別為977 nt(快速生長期)和1 135 nt(骨化期)(圖1)。

2.2 蛋白數(shù)據(jù)庫比對及差異基因表達分析

通過BLASTX程序比對，將Unigenes與nr、Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，以E<10-5為評價標準，與2個數(shù)據(jù)庫同時比對上的Unigenes共有28 388條。針對這些Unigenes，采用FPKM法進行基因表達量分析，采用DEGseq進行差異基因表達分析，共篩選出5 246條差異表達基因[log2(Fold change)≥1或≤-1；FDR≤0.001]。與快速生長期比較，骨化期顯著上調(diào)的差異表達基因有 2 627條，顯著下調(diào)的差異表達基因有2 619條。

2.3 GO功能和KEGG代謝通路富集分析

將差異表達基因與GO數(shù)據(jù)庫進行比對，差異表達基因顯著富集的GO條目特征為：細胞組分分類主要包括細胞部分(cell part)、細胞(cell)和細胞器(organelle)等；分子功能分類主要包括結(jié)合活性(binding)和催化活性(catalytic activity)等；生物進程分類主要包括細胞進程(cellular process)、單細胞進程(single-organism process)和代謝進程(metabolic process)等(圖2)。

將差異表達基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，差異表達基因顯著富集的代謝通路主要包括細胞通訊(cell communication)、信號分子及相互作用(signaling molecules and interaction)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signaling transduction)和免疫系統(tǒng)(immune system)等(圖3)。

2.4 差異表達生長因子、轉(zhuǎn)錄因子及膠原成分篩選

根據(jù)功能富集和代謝通路分析結(jié)果，推測這些差異表達基因主要為生長因子、轉(zhuǎn)錄因子和膠原類成分。因此，根據(jù)差異表達基因的注釋結(jié)果，結(jié)合目前已發(fā)現(xiàn)和報道的這3類差異表達基因進行進一步的篩選和分析。

圖1 快速生長期和骨化期梅花鹿茸皮組裝序列長度分布Fig. 1 Length distribution of Unigenes of Cervus nippon antler velvet skins at rapid growth and ossification stages

圖2 差異表達基因GO功能富集分析Fig. 2 GO enrichment of differentially expressed genes (DEGs)

圖3 差異表達基因KEGG代謝通路富集分析Fig. 3 KEGG pathway enrichment of differentially expressed genes (DEGs)

2.4.1 生長因子類差異表達基因在快速生長期和骨化期茸皮差異表達基因中，共篩選出7種生長因子(表1)。與快速生長期比較，骨化期茸皮中表達量顯著上調(diào)的生長因子主要包括成纖維細胞生長因子7(Fgf7)和12(Fgf12)以及血管內(nèi)皮生長因子A(Vegfa)；表達量顯著下調(diào)的生長因子主要包括血小板衍生生長因子A(Pdgfa)、轉(zhuǎn)化生長因子β3(Tgfβ3)、表皮生長因子樣蛋白7(Egfl7)和血管內(nèi)皮生長因子B(Vegfb)。

2.4.2 轉(zhuǎn)錄因子類差異表達基因在快速生長期和骨化期茸皮差異表達基因中，共篩選出25種轉(zhuǎn)錄因子(表2)。與快速生長期比較，骨化期茸皮中表達量顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有12種(Pou2f3、Elf2、Bclaf1、Sox6、Runx1、Nfyb、Carf、Nr2f2、Elf1、Atf1、Atf6α和Bbx)，表達量顯著下調(diào)的有13種(Sox12、Ebf3、E4f1、Scx、Tcf4、Nr2f1、Mafk、Ubtf、Crebzf、Elf4、Tfe3、Sox4和Sox18)。

表1 不同生長時期梅花鹿茸皮生長因子類差異表達基因Table 1 Differentially expressed growth factor-related genes of Cervus nippon antler velvet skins at different growth stages

2.4.3 膠原類差異表達基因在快速生長期和骨化期茸皮差異表達基因中，共篩選出6種膠原分子(表3)。與快速生長期比較，骨化期茸皮中表達量顯著上調(diào)的膠原分子包括Col24a1和Col12a1；表達量顯著下調(diào)的包括Col13a1、Col27a1、Col3a1和Col1a1。

3 討論

組織損傷修復(fù)是涉及多種細胞和生物大分子參與的復(fù)雜的功能組織重建過程，由于人體皮膚、軟骨和骨組織的再生能力差，損傷后很難修復(fù)和再生，因此，組織損傷修復(fù)一直是臨床治療上的難點(Huetal.， 2014)。鹿茸生長過程非常獨特，具有循環(huán)再生和快速生長的特點，鹿茸的茸皮、軟骨和骨等組織在結(jié)構(gòu)和功能上與正常組織存在巨大的差別(Lietal.，2014)。因此，探尋鹿茸生長過程中不同組織基因表達變化，將有利于揭示鹿茸獨特生長過程的內(nèi)在分子機制，為組織損傷修復(fù)的臨床研究提供理論指導(dǎo)。本研究針對快速生長期和骨化期鹿茸生長中心茸皮組織進行深度轉(zhuǎn)錄組測序，采用生物信息學分析方法對測序結(jié)果進行組裝拼接和差異基因表達分析，篩選出7種生長因子、25種轉(zhuǎn)錄因子和6種膠原分子，這些調(diào)控因子在組織損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。

表2 不同生長時期梅花鹿茸皮轉(zhuǎn)錄因子類差異表達基因Table 2 Differentially expressed transcription factor-related genes ofCervus nippon antler velvet skins at different growth stages

表3 不同生長時期梅花鹿茸皮膠原類差異表達基因Table 3 Differentially expressed collagen-related genes of Cervus nippon antler velvet skins at different growth stages

研究結(jié)果表明，鹿茸在不同生長過程中，茸皮中基因表達水平差異顯著。在快速生長過程中，茸皮生長主要由生長因子Pdgfa、Tgfβ3、Egfl7和Vegfb調(diào)控，并通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Sox12、Ebf3、E4f1、Scx、Tcf4、Nr2f1、Mafk、Ubtf、Crebzf、Elf4、Tfe3、Sox4和Sox18，促進膠原分子Col13a1、Col27a1、Col3a1和Col1a1的表達；而在骨化過程中，茸皮生長主要由生長因子Fgf7、Fgf12和Vegfa調(diào)控，并通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Pou2f3、Elf2、Bclaf1、Sox6、Runx1、Nfyb、Carf、Nr2f2、Elf1、Atf1、Atf6α和Bbx，促進膠原分子Col24a1和Col12a1的表達。

在組織損傷修復(fù)過程中，生長因子Pdgf、Egf、Vegf、Fgf和Tgf等通過調(diào)控細胞的趨化、有絲分裂、血管生成以及細胞外基質(zhì)的合成，進而調(diào)控組織損傷修復(fù)(Baeetal.， 2014)。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Sox4和Sox12同屬于SoxC家族，在胚胎發(fā)育和組織器官形成過程中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控細胞的存活、增殖和分化促進組織損傷修復(fù)(Lefebvre & Bhattaram，2016；Chang & Hertz，2017；Muetal.，2017；Kavyanifaretal.，2018)。在組織損傷修復(fù)過程中，Tgfβ通過激活并上調(diào)Scx表達，促進細胞基質(zhì)分泌進而加速創(chuàng)傷愈合(Sakabeetal.，2018)。此外，研究也表明轉(zhuǎn)錄因子E4f1、Tcf4和Elf4在人和小鼠組織損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用(Sivinaetal.，2011；Luetal.，2012；Goguet-Rubioetal.，2016)。鹿茸每年可以采集2次，生茸后60 d可以采集1次，俗稱頭茬茸，鹿茸斷面?zhèn)谟虾罂梢栽俅伍L出鹿茸，俗稱二茬茸(Suttie & Fennessy，1985；張嵩，李峰，2013)。本研究結(jié)果表明，在快速生長期，由于茸皮中促進組織損傷修復(fù)的基因顯著上調(diào)，有利于鹿茸損傷后的創(chuàng)口愈合進而再生出新鹿茸。因此，本研究在梅花鹿茸皮中鑒定出的相關(guān)調(diào)控因子對于組織損傷修復(fù)的臨床研究具有重要的指導(dǎo)意義。