趙亞琴,楊靜

(山西大學 分子科學研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

0 引言

人中心蛋白2(human centrin 2,HsCen2)是真核生物中高度保守、結合Ca2+的一種弱酸性蛋白,屬于EF-hand超家族中鈣調蛋白(calmodulin,CaM)的成員之一[1-3]。中心蛋白與中心體和基體功能密切相關,它主要集中在微管組織中心(microtubule-organizing centers,MTOC)周圍,在細胞分裂過程中扮演著多重角色,參與中心體的復制和分離,并且是核苷酸切除修復系統(tǒng)中必不可少的成員[4]。該蛋白由172個氨基酸殘基組成,其分子量約為20 kDa。

磷酸化是通過蛋白激酶將ATP的磷酸基轉移到蛋白特定位點上的生化過程。磷酸化的作用位點為蛋白上的Ser、Thr或Tyr殘基[5]。在磷酸化調節(jié)過程中,細胞的形態(tài)和功能都會發(fā)生改變。可逆的磷酸化過程幾乎涉及所有的生理及病理過程,包括細胞周期、基因轉錄和 RNA翻譯后的調控、代謝通路、神經元生長、信號轉導以及記憶過程等[6-8]。研究表明,磷酸化可以調節(jié)中心蛋白的結構和生化活性,人中心蛋白和綠藻中心蛋白都可以在體內發(fā)生磷酸化,人中心蛋白2的磷酸化修飾與中心體的復制有關。綠藻中心蛋白的磷酸化作用與鞭毛根部的收縮和擴張以及細胞核的運動有關[9-11]。在癌癥研究中發(fā)現(xiàn),微管蛋白的磷酸化可能導致癌癥的發(fā)生[12]。1998年,Lingle等人在乳腺癌細胞的中心體中發(fā)現(xiàn)了中心蛋白的異常磷酸化,這表明磷酸化的中心蛋白的產生與異常的細胞周期調節(jié)有關。在磷酸化后,中心蛋白的構象和表面電荷發(fā)生變化,這可能會影響它與下游靶蛋白結合[9]。因此,研究中心蛋白的磷酸化行為是很重要的。

中心蛋白生物功能的實現(xiàn)與其靶蛋白密切相關[13]。中心蛋白與其下游靶蛋白共同參與，完成了核苷酸切除、修復與識別過程,著色性干皮病組C蛋白 (Xeroderma Pigmentosum Group C Protein,XPC)為其中的一個重要蛋白[14]。HsCen2可以與XPC的一段氨基酸組成的小肽以1∶1形式結合,形成穩(wěn)定的二元復合物。復合物HsCen2-XPC的晶體結構(PDB ID:2OBH)也進一步證實了該結論[15]。蜂毒素是一種鈣調蛋白作用的模擬靶肽,包含26個氨基酸殘基(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2),在生理pH條件下,帶有5個單位的正電荷[16]。它具有與中心蛋白靶蛋白結合的保守性序列WLL。本文以蜂毒素為人中心蛋白2的模擬靶肽,通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native polyaarylamide gel electrophoresis,native-PAGE)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS polyarylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、熒光光譜以及遠紫外圓二色光譜(CD)方法研究了蜂毒素與磷酸化前后人中心蛋白2的相互作用。結果表明蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)可以催化HsCen2 Ser170磷酸化反應,形成磷酸化的HsCen2(phosphorylated HsCen2,HsCen2p),磷酸化修飾后使得蛋白的α-螺旋含量明顯減少,疏水空腔外露程度減弱。熒光光譜表明HsCen2、HsCen2p與蜂毒素均可形成1∶1的復合物,其結合能力分別為(3.9±0.12)×106、(1.5±0.05)×105L/mol。

1 實驗部分

1.1 材料

三磷酸腺苷二鈉(ATPNa2),超高純級,Solarbio公司;N-2-羥乙基哌嗪-N′-乙磺酸(4-(2-Hydroxy Ethyl)-1-Piperazine Ethane Sulfonic acid,Hepes),分析純,Sigma公司;2-對甲苯胺基-6-萘磺酸(2-p-toluidinyinaphthalene-6-sulfonate,TNS),純度95%(質量分數(shù)),Sigma公司;蜂毒素(melittin),純度達95%(質量分數(shù))以上,Sigma公司。

1.2 HsCen2磷酸化修飾

人中心蛋白2(human centrin 2,HsCen2)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的表達、純化均與八肋游仆蟲中心蛋白類似[5]。將純化得到的HsCen2 (5×10-3mol/L)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)(0.5 mg/mL)與Mg2+(1.1×10-2mol/L)、ATPNa2(2.42×10-3mol/L) 溶解在0.01 mol/L的Hepes中,30℃條件下恒溫水浴孵育10 h。多余的金屬離子、ATP等通過PD-10脫鹽柱除去。蛋白濃度采用Cary 50 UV-Vis紫外可見分光光度計測定280 nm處的吸光度,根據(jù)朗伯比爾定律A=εbc測定蛋白的濃度。ε280(HsCen2p)=1 490 L/mol·cm。

1.3 遠紫外圓二色光譜

CD光譜的測定在室溫下，0.01 mol/L Hepes,pH=7.4,光程為1 mm,使用Applied Photophysics 型圓二色譜儀進行數(shù)據(jù)采集。掃描范圍為190 nm～250 nm。實驗所獲得的光譜圖均為3次取其平均值,其中α-螺旋含量通過楊氏方程[16]求得。

(1)

1.4 熒光光譜測定

使用HORIBA-FluoroMax-4型熒光光譜儀測定TNS與HsCen2、HsCen2p的相互作用,激發(fā)波長為320 nm,激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為10 nm,反應時間間隔均為3 min。為消除滴定過程中的稀釋效應,數(shù)據(jù)處理過程中將熒光強度轉化為摩爾熒光強度。

同樣使用HORIBA-FluoroMax-4型熒光光譜儀測定磷酸化前后人中心蛋白2與melittin的相互作用,激發(fā)波長為295 nm,掃描范圍為305～550 nm,激發(fā)狹縫寬度和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm,反應時間間隔為3 min,結合常數(shù)為Ka和結合位點數(shù)n,由公式(2)求得。

(2)

F0,F分別為蛋白(HsCen2、HsCen2p)中存在或不存在melittin條件下蛋白在331 nm處的熒光強度。[Q]為蛋白(HsCen2、HsCen2p)的濃度,通過log[(F0-F)/(F-F∞)]對log[Q]作圖,獲得結合位點數(shù)及結合常數(shù)。數(shù)據(jù)處理過程中扣除滴定過程中所產生的稀釋效應。所有熒光實驗均在室溫獲得。

2 結果與討論

2.1 人中心蛋白2的磷酸化修飾

在30℃，ATP、Mg2+存在下,蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)與HsCen2過夜反應,HsCen2表達、純化的SDS-PAGE圖為1(A)所示。磷酸化反應產物電泳遷移結果如圖1(B)所示。蛋白激酶A的磷酸化作用位點為蛋白上的Ser和Thr,由于HsCen2的C末端包含了蛋白激酶A可以識別的共有序列(KKTS*LY)[17],而Ser恰好位于HsCen2的第170位氨基酸,所以在特定的條件下,蛋白激酶A可以對HsCen2的Ser170的位點進行磷酸化修飾。磷酸化修飾HsCen2使得Ser170與磷酸氫根形成酯健,蛋白所帶負電荷有所增加,另一方面,蛋白質被磷酸化修飾后,其自身的形態(tài)和功能會發(fā)生一定的改變,同時蛋白質的分子量增加。如果只有單一的氨基酸殘基被磷酸化,則其分子量相應的增加80 Da[15]。該蛋白在native-PAGE中的遷移率受到電荷影響更為明顯，因此磷酸化后更靠近負極[17]。

Fig.1 (A) SDS-PAGE analyze of HsCen2 expression and purified. Lane M was the protein molecular weight standards; Lane1, Lane2, Lane3 were induced to express the whole bacteria, supernatant and precipitation respectively. Lane 4 was the purified target protein.(B) Native PAGE analysis of HsCen2 (lane 1) and HsCen2p (lane 2)圖1 (A) SDS-PAGE分析HsCen2表達、純化圖。泳道M為蛋白標準分子量,泳道1、2、3分別為誘導表達后的全菌、上清、沉淀,泳道4為目標蛋白。(B) HsCen2和HsCen2p天然膠電泳圖

DEAE離子交換層析保留了瓊脂糖極好的親水性,與生物活性大分子有很好的相容性,具有離子交換容量高、特異性吸附少和流速快等特點,廣泛用于蛋白質、核酸及多肽等生物大分子的實驗室制備。本文通過DEAE離子交換層析法檢測HsCen2和HsCen2p的行為差異。如圖2所示,HsCen2在DEAE的洗脫體積為33.7 mL,而HsCen2p在DEAE的洗脫體積為34.5 mL,洗脫體積明顯增大。DEAE陰離子交換層析柱結合帶有負電荷的蛋白質,所以這類蛋白質被留在柱子上,然后通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合能力較弱的蛋白質首先被洗脫下來,磷酸化修飾HsCen2后蛋白所帶負電荷增多,使得HsCen2p與DEAE離子交換層析柱結合能力增強,洗脫時置后與HsCen2蛋白,從而洗脫柱體積增加。結合PKA對蛋白磷酸化修飾的氨基酸序列要求,可進一步證明PKA可以對HsCen2進行磷酸化修飾,且Ser170為其磷酸化位點。

Fig.2 Elution peaks of HsCen2 and HsCen2p in DEAE affinity chromatography圖2 HsCen2和HsCen2p在DEAE親和層析柱中的洗脫峰

2.2 磷酸化修飾后人中心蛋白2的構象變化

Fig.3 (A) Fluorescent spectra of TNS alone (a)，in the presence of HsCen2 (b) and HsCen2p (c); in 0.01 mol/L Hepes, (pH 7.4, at 25 ℃), [Protein]=10 μmol, [TNS]/[Protein]=10∶1.(B) Far-UV CD spectra of HsCen2 (a) and HsCen2p (b).圖3 (A) TNS在不同溶液中的熒光光譜,TNS (a),HsCen2-TNS (b),HsCen2p-TNS (c); 在0.01 mol/L Hepes (pH 7.4, 25 ℃) 的條件下, [蛋白]=10 μmol,[TNS]/[蛋白]=10∶1。(B) HsCen2 (a) 和HsCen2p (b) 的遠紫外圓二色光譜

2-對甲苯胺基-6-萘磺酸(TNS)是一種重要的疏水性熒光探針,它在極性溶劑中與非極性溶劑中的熒光峰位置、峰強度明顯不同[16]。據(jù)此,可通過觀察TNS熒光峰的移動以及強度變化來探測蛋白質的結構變化。由圖3(A)可見,0.01 mol/L Hepes緩沖溶液中,TNS的熒光強度幾乎為零(圖3(A)曲線a),在HsCen2溶液中加入TNS([TNS]/[HsCen2]=10∶1)后其熒光強度增大到4.1倍(圖3(A)曲線b),證明TNS的微環(huán)境發(fā)生了改變;同時伴隨TNS熒光峰從505 nm移動到438 nm,探針微環(huán)境的極性增大,推測TNS與HsCen2的疏水腔存在相互作用。同樣,將TNS加入到HsCen2p溶液中([TNS]/[HsCen2p]=10∶1)也可以觀察到探針熒光峰從505 nm移動到433 nm,熒光強度增強了2.1倍(圖3(A)曲線c)。與HsCen2相比,磷酸化修飾后中心蛋白的疏水結構域的外露程度明顯減弱。Ser170磷酸化修飾后改變了蛋白的構象,因此導致其熒光強度明顯不同。由圖3(B)曲線a可見,HsCen2的遠紫外圓二色光譜在208 nm以及222 nm處有負吸收出現(xiàn),這是富含α-螺旋結構蛋白質的典型特征(由楊氏方程(1)計算得知)HsCen2的α-螺旋含量為53%。HsCen2p的遠紫外圓二色光譜信號也出現(xiàn)在208 nm和222 nm,但其CD信號值減小22%,說明Ser170磷酸氫根的引入引起中心蛋白二級結構的改變。

2.3 HsCen2、HsCen2p與蜂毒素的相互作用

HsCen2屬于僅含苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)而不含有色氨酸(Trp)殘基的A類蛋白,蜂毒素含有一個Trp,因此可以利用蜂毒素中Trp為探針分子去檢測中心蛋白與蜂毒素的作用[18]。由圖4(A)曲線b可見,蜂毒素的熒光峰位于356 nm,與Trp在水溶液中的發(fā)射光譜相似,證明色氨酸的微環(huán)境是親水的。將HsCen2加入到蜂毒素溶液中蜂毒素的熒光峰逐漸藍移到340 nm(曲線c),表明蜂毒素的Trp殘基的微環(huán)境發(fā)生了改變,從一個極性環(huán)境轉移到了一個非極性的疏水性的環(huán)境中。同時伴隨有Trp殘基的熒光強度大大增強,推測HsCen2與蜂毒素發(fā)生了相互作用。另外,等當量蜂毒素與HsCen2混合溶液的熒光光譜(曲線c)與HsCen2熒光光譜與蜂毒素光譜的理論加和光譜(曲線d)圖完全不同,進一步證明蜂毒素與HsCen2相互作用形成了復合物。HsCen2滴定蜂毒素的熒光光譜見圖4(B)。隨著HsCen2的加入,蜂毒素Trp熒光峰逐漸移動,熒光強度逐漸增強,當[HsCen2]/[蜂毒素]=1∶1時熒光強度值達到最大,說明HsCen2與蜂毒素可以形成1∶1復合物。由HsCen2對蜂毒素滴定的滴定曲線(圖4B插圖),由公式(2)計算得到其結合常數(shù)為(3.9±0.12)×106L/moL。同樣,PKA磷酸化HsCen2后的蛋白HsCen2p可以與蜂毒素結合,其熒光發(fā)射峰位置也有相應的移動,其結合比為1∶1,圖4(C)插圖由公式(2)計算得結合常數(shù)為(1.5±0.05)×105L/mol。結合TNS檢測磷酸化前后蛋白的疏水表面暴露減少,進一步證明磷酸化修飾HsCen2使得Ser170與磷酸氫根形成酯健后改變了蛋白的構象,由于磷酸化位點和靶肽結合位點都在HsCen2的C末端,而磷酸化位點不在EF-hand結構域,帶有5個單位正電荷的蜂毒素與HsCen2 C端的EF-hand結構域作用時,并沒有受磷酸化負電荷增加的影響,只是由于疏水腔暴露減小的原因,已有文獻報道蛋白與靶肽的主要作用力為疏水作用[11],進一步論證了磷酸化修飾后降低了蛋白與蜂毒素的相互作用能力。

(A) HsCen2 (a), melittin (b), complex of HsCen2-melittin (c), and the calculated sum spectra of the same concentration of HsCen2 and melittin (d). (B) Fluorescence titration spectra of the melittin by HsCen2. InsetPlot of fluorescence intensities of protein at 331nm as a function of [HsCen2]/[melittin]. (C) Fluorescence titration spectra of the melittin by HsCen2p. InsetPlot of fluorescence intensities of protein at 331nm as a function of [HsCen2p]/[melittin]Fig.4 Fluorescence spectra of HsCen2 and melittin monitored by Trp fluorescence of melittin in 0.01 mol/L Hepes (pH 7.4)(A) HsCen2 (a),蜂毒素 (b),HsCen2-蜂毒素的復合物(c),HsCen2與蜂毒素的熒光光譜強度的疊加(d);(B) HsCen2滴定蜂毒素的熒光光譜,插圖為331nm 處的熒光強度隨[HsCen2]/[蜂毒素]比值的變化曲線;(C) HsCen2p滴定蜂毒素的熒光光譜,插圖為331nm 處的熒光強度隨[HsCen2p]/[蜂毒素]比值的變化曲線圖4 HsCen2與蜂毒素的相互作用的熒光光譜

如上所述,HsCen2是典型富含α-螺旋二級結構的蛋白。溶液中游離靶肽沒有經典的二級結構,因此可以通過檢測中心蛋白CD信號的變化研究HsCen2與蜂毒素的相互作用。如圖5A曲線a所示,蜂毒素在溶液中呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲[16]。將等當量蜂毒素加入HsCen2溶液中,由楊氏方程(1)計算得知HsCen2的α-螺旋含量減小23%。(圖5(A)中b),曲線c為HsCen2的CD光譜圖,證明蜂毒素與中心蛋白結合后二級結構發(fā)生變化。當HsCen2p溶液(圖5(B)中c)中加入蜂毒素 (圖5(B)中a)時,混合溶液的CD信號(圖5(B)中b)與HsCen2p相比變化不明顯,說明磷酸化修飾改變了中心蛋白與蜂毒素的作用。

(A) CD spectral of melittin (a), HsCen2-melittin complex ([HsCen2]/[melittin]=1) (b), HsCen2 (c); (B) CD spectral of melittin (a), HsCen2p-melittin complex ([HsCen2p]/[melittin]=1) (b), HsCen2p (c)Fig.5 Far-UV CD spectra of HsCen2 and HsCen2p in the absence or presence of melittin(A) HsCen2與蜂毒素的相互作用的光譜圖,蜂毒素 (a), HsCen2-蜂毒素的復合物([HsCen2]/[蜂毒素]=1) (b), HsCen2 (c);(B) HsCen2p與蜂毒素的相互作用的光譜圖,蜂毒素(a), HsCen2p-蜂毒素的復合物([HsCen2p]/[蜂毒素]=1) (b), HsCen2p (c)圖5 蜂毒素與 HsCen2、HsCen2p相互作用的遠紫外圓二色光譜圖

3 結論

本文通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、熒光光譜及遠紫外圓二色光譜法探究了HsCen2、HsCen2p與蜂毒素的相互作用。結果表明,蛋白激酶A可以催化HsCen2使得其發(fā)生磷酸化反應,磷酸化修飾后的HsCen2構象有所改變。HsCen2、HsCen2p都可以與蜂毒素形成1∶1復合物,其結合常數(shù)分別為:(3.9±0.12)×106、(1.5±0.05)×105L/mol。說明磷酸化修飾HsCen2使得Ser170與磷酸氫根形成酯健后改變了蛋白的構象,從而降低了蛋白與蜂毒素的相互作用能力。