牛樹(shù)輝，陳夢(mèng)飛，呂帥飛，李聲平，楊紅飛，高小蟬

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

大鯢(Andriasdavidianus)俗稱(chēng)娃娃魚(yú)，隸屬于隱鰓鯢科大鯢屬，是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動(dòng)物，也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖物種。大鯢肉質(zhì)鮮嫩、味道鮮美，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)還是一種名貴的傳統(tǒng)藥材。近年來(lái)，隨著大鯢人工養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，在飼養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)了很多問(wèn)題，其中疾病是影響大鯢規(guī)?；B(yǎng)殖的主要難題。細(xì)菌性病原是大鯢疾病的主要病原之一，給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，極大地影響了大鯢養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。但是由于大鯢養(yǎng)殖范圍的局限性，大鯢細(xì)菌性病原的生物學(xué)基礎(chǔ)研究相對(duì)滯后。近年來(lái)，一些與大鯢病害相關(guān)的細(xì)菌性病原陸續(xù)被分離出來(lái)，包括嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[1-3]、Ⅰ-型熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)[4]、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[5]、類(lèi)志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)[6]、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)[7]、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)[8]和遲鈍愛(ài)德華菌(Edwardsiellatarda)[9]等。

希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)作為一種革蘭氏陰性菌，隸屬于弧菌科(Vibrionaceae)，目前已從水生環(huán)境、沉淀物、石油環(huán)境及冷藏食品中分離到20多株[10-11]。此外，希瓦氏菌也是多種水生動(dòng)物的細(xì)菌性病原，其宿主不僅包括半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevisgunther)、大菱鲆(Psettamaxima)、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[12]、東風(fēng)螺(Babylonia)[13-14]、海馬(Hippocampus)[15]、大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocer)[16]等海水養(yǎng)殖動(dòng)物，還包括鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)[17]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[18]、烏蘇里擬鲿(Pseudobagrusussuriensis)[19]等淡水養(yǎng)殖動(dòng)物。近年來(lái)，其宿主范圍不斷擴(kuò)大，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅，但目前尚未有希瓦氏菌作為兩棲類(lèi)動(dòng)物病原的相關(guān)報(bào)道。

本研究利用平板劃線(xiàn)法從患病大鯢中進(jìn)行細(xì)菌分離，對(duì)分離菌進(jìn)行革蘭氏染色、透射電鏡觀察、16S rDNA序列鑒定、人工感染及藥敏試驗(yàn)分析，并對(duì)患病大鯢進(jìn)行病理學(xué)觀察，為大鯢疾病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試動(dòng)物 患病大鯢(體長(zhǎng)為10～15 cm)由河南省洛陽(yáng)市欒川縣某大鯢養(yǎng)殖廠提供，健康大鯢由河南華鯢生物科技股份有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 PCR引物合成及序列測(cè)定由生工生物工程股份有限公司完成；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、溶菌酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、TaqDNA聚合酶、dNTP均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Transgene公司；胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、瓊脂、磷鎢酸(Phosphotungstic acid，PTA)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自常州朗越儀器制造有限公司；培養(yǎng)箱購(gòu)自上海智城分析儀器制造公司；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；透射電鏡購(gòu)自日本JEOL公司。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)、革蘭氏染色及鏡檢

從患病大鯢中選取癥狀典型的瀕死大鯢，用75%乙醇對(duì)大鯢體表進(jìn)行消毒，在超凈工作臺(tái)中取出一小塊肝臟和脾臟組織，研磨后分別在普通LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線(xiàn)，并于37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取形態(tài)基本一致的單菌落，再進(jìn)行3次劃線(xiàn)培養(yǎng)，獲得純化的病原分離菌株。將分離到的各菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，一部分加甘油于-80 ℃保存?zhèn)溆肹20]，另一部分進(jìn)行革蘭氏染色并置于顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)。

1.3 分離病原菌的基因組DNA提取及16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增

依照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取分離病原菌的基因組DNA。設(shè)計(jì)的16S rDNA通用引物為16S rDNA-F：5′-GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3′；16S rDNA-R：5′-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 459 bp。以各分離病原菌株的基因組DNA為模板，以16S rDNA-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，TaqDNA聚合酶 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL,ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min后置于4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物并送測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件在NCBI上進(jìn)行同源性搜索，然后分別用Clustal 1.83軟件和MEGA 5.0軟件進(jìn)行序列對(duì)比并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[21]。

1.4 分離病原菌培養(yǎng)基的初步優(yōu)化

首先，分別以牛肉膏、葡萄糖、蔗糖作為菌株培養(yǎng)的唯一碳源，分別以蛋白胨、酵母粉和胰蛋白胨作為菌株培養(yǎng)的唯一氮源，分別以NaCl、MgSO4、K2SO4作為菌株培養(yǎng)的唯一無(wú)機(jī)鹽；固定添加0.4%碳源、1.0%氮源、0.4%無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)LB液體培養(yǎng)基作為分離病原菌的培養(yǎng)基，并調(diào)整其pH值為7；然后接種5%分離病原菌于配制好的培養(yǎng)基中，37 ℃分別振蕩培養(yǎng)24、36、48 h后測(cè)定OD600值，結(jié)合不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽條件下分離病原菌的生長(zhǎng)情況，選擇出最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽。其次，在確定最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽后，通過(guò)調(diào)整其濃度并測(cè)定分離病原菌的生長(zhǎng)情況，篩選出最適的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的濃度。

1.5 分離病原菌的電鏡觀察

將覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)(孔徑113 μm)粘在載玻片的雙面膠上，正面朝上，分別取5 μL分離病原菌懸液樣品滴至銅網(wǎng)上，于室溫放置10 min后用濾紙吸去多余懸液。將銅網(wǎng)正面朝上置于蠟板上，滴加一滴2%的PTA后，避光染色3～4 min，再用濾紙吸去多余染液，晾干后進(jìn)行電鏡觀察并拍照。

1.6 分離病原菌人工感染大鯢

取保存的分離病原菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行離心后重懸，參照MCFARLAND比濁法利用PBS將菌液濃度調(diào)整為1×108cfu/mL。

將健康大鯢先于室內(nèi)暫養(yǎng)7 d，水溫控制在(15±2)℃。然后將其隨機(jī)分為2組，每組6尾，水溫控制在(28±2)℃，分別對(duì)試驗(yàn)組每尾大鯢肌肉注射0.5 mL分離病原菌懸液，分別對(duì)對(duì)照組每尾大鯢肌肉注射等體積的PBS。分離病原菌的人工感染試驗(yàn)期間不進(jìn)行投喂，每天換水一次，密切觀察發(fā)病情況，并從瀕臨死亡的大鯢中分離病原菌。

1.7 分離病原菌的藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。取100 mL新鮮菌懸液(濃度約1×107cfu/mL)均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌鑷子將直徑6 mm的藥敏紙片(甲砜霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、乳酸諾氟沙星、四黃抗毒、磺胺二甲氧嘧啶鈉、硫氰酸紅霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、保肝解毒寧、鹽酸黃連素)均勻平貼在平板上，設(shè)3個(gè)重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑。參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行結(jié)果判定，將抑菌圈直徑在20 mm以上判定為極度敏感(E)、在15～20 mm判定為高度敏感(S)、在10～15 mm判定為中度敏感(I)、小于10 mm的判定為不敏感(R)。

1.8 患病大鯢組織病理學(xué)觀察

取健康及患病瀕死大鯢的肝臟、脾臟、腎臟和肺臟組織，經(jīng)苦味酸固定液固定后，再經(jīng)洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、水化、烤片、HE染色、封片等步驟最終制成組織切片，然后置于顯微鏡下觀察各組織病理變化[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病大鯢的臨床癥狀觀察及剖檢病理變化

患病大鯢體表黏液脫落，頭部出現(xiàn)綠豆大小的白點(diǎn)或成片的白斑區(qū)域，腹部潰爛，四肢嚴(yán)重腫大、出血，皮膚有潰瘍，部分趾甚至脫落，尾部潰爛。

剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，患病大鯢腸內(nèi)無(wú)食，腸胃之間有粘連，內(nèi)有血絲和黃色黏液；肝臟明顯腫大、充血或呈灰白色，甚至嚴(yán)重變形；膽呈黃色，腎臟腫大，脾臟出血甚至嚴(yán)重潰爛，部分肝臟和脾臟粘連，肺臟萎縮。

2.2 大鯢病原菌的分離與革蘭氏染色

通過(guò)平板劃線(xiàn)法共分離到5株大鯢的病原菌，包括肝臟中2株、脾臟中1株和腸中2株，分別編號(hào)為L(zhǎng)Y1—LY5。分離到的5株大鯢病原菌在LB平板上的菌體形態(tài)相似，均為表面光滑、邊緣整齊、稍微隆起的圓形不透明的淡黃色菌落。對(duì)大鯢的病原菌進(jìn)行革蘭氏染色后通過(guò)鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，菌株LY1—LY5的菌落形態(tài)一致，均呈紅色、桿菌，因此均為革蘭氏陰性桿菌。

2.3 大鯢病原菌的16S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析

如圖1所示，PCR擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在1 500 bp左右有1條目的條帶，與預(yù)期大小(1 459 bp)一致。從GenBank中選取最相似菌株的16S rDNA序列，與分離病原菌的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，大鯢分離病原菌株LY1—LY5的16S rDNA序列與希瓦氏菌的序列相似度高達(dá)99%，則分離病原菌株LY1—LY5為希瓦氏菌。同時(shí)，選擇其中序列最長(zhǎng)的分離病原菌株LY3作為代表株進(jìn)行后續(xù)研究。由圖2可知，在構(gòu)建的大鯢分離病原菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中，菌株LY3與希瓦氏菌(Shewanellasp. NF20111223D，登錄號(hào)：KC916743.1)同源性最高，親緣關(guān)系最近。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；C：陰性對(duì)照；

2.4 不同碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)和添加量對(duì)大鯢分離病原菌生長(zhǎng)的影響

由圖3A可知，在培養(yǎng)24、36、48 h，選擇蔗糖作為大鯢分離病原菌株生長(zhǎng)的唯一碳源時(shí)，菌體生長(zhǎng)最好，當(dāng)固定牛肉膏和葡萄糖作為唯一碳源時(shí)，大鯢分離病原菌的生長(zhǎng)相對(duì)較弱，因此選擇蔗糖作為其生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的唯一碳源。由圖3B可知，當(dāng)蔗糖的添加量為0.3%時(shí)，菌體生長(zhǎng)最佳。由圖3C可知，在培養(yǎng)24、36、48 h，選擇酵母粉作為大鯢分離病原菌株生長(zhǎng)的唯一氮源時(shí)，菌體生長(zhǎng)最好，而選擇蛋白胨和胰蛋白胨作為唯一氮源時(shí)，菌體生長(zhǎng)相對(duì)較弱，因此,選擇酵母粉作為大鯢分離病原菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的唯一氮源。如圖3D所示，當(dāng)酵母粉的添加量為1.2%時(shí)，菌體生長(zhǎng)最佳。如圖3E所示，在培養(yǎng)24、36、48 h，選擇MgSO4作為大鯢分離病原菌株生長(zhǎng)的唯一無(wú)機(jī)鹽時(shí)，菌體生長(zhǎng)最好，而當(dāng)NaCl和K2SO4作為唯一無(wú)機(jī)鹽時(shí)，菌體生長(zhǎng)相對(duì)較弱，因此選擇MgSO4作為菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽。如圖3F所示，當(dāng)MgSO4的添加量為0.6%時(shí)，菌體生長(zhǎng)最佳。

圖2 大鯢分離病原菌株LY3的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 16S rDNA phylogenetic tree of isolated bacterial strain

A：大鯢分離病原菌LY3在添加不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、36、48 h后的生長(zhǎng)情況；B：不同蔗糖添加量下大鯢分離病原菌的生長(zhǎng)情況；

2.5 大鯢分離病原菌株LY3的透射電鏡觀察

如圖4所示，經(jīng)PTA負(fù)染后，在透射電鏡下觀察，大鯢分離病原菌株LY3均呈桿狀，兩端鈍圓。

圖4 分離菌株LY3的透射電鏡圖片F(xiàn)ig.4 Transmission electron micrograph of strain LY3

2.6 大鯢分離病原菌株LY3的人工感染試驗(yàn)結(jié)果

利用分離病原菌株LY3進(jìn)行人工感染12 h后，大鯢表現(xiàn)為食欲減退且體表黏液開(kāi)始脫落；人工感染60 h后，大鯢的四肢腫大并伴有出血，同時(shí)頭部出現(xiàn)白點(diǎn)和潰瘍，隨后白點(diǎn)和潰瘍?cè)谌磉M(jìn)一步擴(kuò)大；人工感染72 h時(shí)，有4只大鯢死亡，至140 h時(shí)被感染大鯢全部死亡。對(duì)死亡大鯢進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，其肝臟、脾臟均發(fā)生出血、腫大，同時(shí)還出現(xiàn)腎臟腫大，肺萎縮，腸內(nèi)有黃色黏液等癥狀，與自然發(fā)病癥狀基本相同。而從人工感染發(fā)病死亡大鯢的肝臟和脾臟處分離到的病原菌經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢結(jié)果與自然分離的大鯢病原菌株LY3的形態(tài)一致，表明LY3是大鯢的致病菌。

2.7 大鯢分離病原菌株LY3的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，通過(guò)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鯢分離病原菌株LY3對(duì)恩諾沙星極度敏感，對(duì)氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶鈉、乳酸諾氟沙星、硫氰酸紅霉素高度敏感，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑粉(復(fù)方新諾明)、甲砜霉素、磺胺二甲氧嘧啶鈉、四黃抗毒、多西環(huán)素、保肝解毒寧中度敏感，對(duì)鹽酸黃連素耐藥。

2.8 患病大鯢組織病理學(xué)觀察

由圖5所示，對(duì)照組健康大鯢的肝臟切片中肝臟細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞緊密排列，細(xì)胞邊界明顯，組織被肝竇分成很多肝小葉；而感染組患病大鯢的肝臟組織空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞渾濁，肝小葉間界限不分明，肝板排列紊亂。對(duì)照組健康大鯢的脾組織中紅髓和白髓分界清楚，脾細(xì)胞均勻排列；感染組患病大鯢的脾臟組織中紅髓和白髓分界不清楚，大量的嗜酸性細(xì)胞堆集，有大量褐色顆粒出現(xiàn)，多數(shù)細(xì)胞核溶解，出現(xiàn)大量空泡樣變的細(xì)胞。對(duì)照組健康大鯢的腎臟組織中髓質(zhì)、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，近曲小管和腎小管邊界清晰，細(xì)胞均勻排列，細(xì)胞核居中，有些囊腔中出現(xiàn)蛋白質(zhì)分泌物，腎小球細(xì)胞核居中排列；感染組患病大鯢的腎組織壞死，腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)破壞，腎小囊溶解壞死，腎小管裂解，細(xì)胞邊界不清晰，有些細(xì)胞核消失，在管腔中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組健康大鯢的肺組織中肺泡管、肺泡囊和肺泡結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列均勻；感染組患病大鯢的肺組織中細(xì)胞核堆集，細(xì)胞排列紊亂，肺泡囊不明顯，組織纖維化。

表1 大鯢分離病原菌株LY3對(duì)水產(chǎn)常用藥物的敏感性試驗(yàn)分析Tab.1 Analysis of drug-sensitivity test of isolated bacterial strain LY3 from Andrias davidianus

注：E(極度敏感)：抑菌圈直徑>20 mm；S(高敏)：15 mm≤抑菌圈直徑≤20 mm；I(中敏)：10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm；R(耐藥)：抑菌圈直徑<10 mm。

Note: E(Extremely sensitive): Inhibition zone diameter>20 mm; S(Highly sensitive): 15 mm≤Inhibition zone diameter≤20 mm; I(Moderately sensitive): 10 mm≤Inhibition zone diameter<15 mm; R(Resistant): Inhibition zone diameter<10 mm.

圖5 大鯢感染前后不同組織切片的比較病理學(xué)分析Fig.5 Comparative analysis of histopathological features of different issues from healthy giant salamander and Shewanella xiamenensis-infected giant salamander

3 結(jié)論與討論

目前報(bào)道的希瓦氏菌主要是從水生環(huán)境或沉淀物中分離得到，另有少數(shù)腐敗希瓦氏菌是從冷藏的魚(yú)類(lèi)中分離得到[10,24]，但關(guān)于其作為細(xì)菌性病原的研究較少。有研究表明，希瓦氏菌作為條件致病菌能夠感染多種水生動(dòng)物，可致大黃魚(yú)體側(cè)、腹部、鰭基、下頜、鰓蓋等發(fā)紅，使異育銀鯽的腹部出血、膨大，引起烏蘇里擬鲿體表潰瘍癥，還能夠引起泥鰍的腹部和肛門(mén)處出現(xiàn)明顯紅點(diǎn)和紅斑。本研究從大鯢中首次分離到希瓦氏菌，被該病原菌感染后的大鯢可產(chǎn)生皮膚潰瘍、出血等癥狀，且利用分離出的病原菌進(jìn)行人工感染后的大鯢癥狀與自然發(fā)病大鯢癥狀基本相同，并且從人工感染大鯢中分離出的菌株與自然發(fā)病大鯢體內(nèi)分離出的菌株形態(tài)相同。

近年來(lái)，藥敏試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物病害的檢測(cè)，但主要是采用獸用藥敏紙片進(jìn)行，少有以水產(chǎn)動(dòng)物專(zhuān)用藥敏紙片進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)，使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)際應(yīng)用中存在很大的局限性[25]。賈春紅等[13]測(cè)定了3株方斑東風(fēng)螺的病原希瓦氏菌對(duì)35種常用抗菌藥物的敏感性，其中腐敗希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌對(duì)復(fù)方新諾明敏感[16]。秦蕾等[12]從異育銀鯽中分離到的腐敗希瓦氏菌對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星等敏感。林鋒等[18]分離的泥鰍源希瓦氏菌對(duì)復(fù)方新諾明、四環(huán)素等高度敏感。本研究結(jié)果顯示，分離出的大鯢希瓦氏菌LY3對(duì)恩諾沙星的敏感性最強(qiáng)，對(duì)氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶鈉、乳酸諾氟沙星和硫氰酸紅霉素次之，與秦蕾等[12]的報(bào)道有相似性，與賈春紅等[13]和林鋒等[18]的報(bào)道不同，推測(cè)可能是由于不同種類(lèi)水生動(dòng)物的希瓦氏菌對(duì)抗生素的敏感性不同。

針對(duì)水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病治療，水產(chǎn)養(yǎng)殖一直依賴(lài)消毒劑和抗生素，但近年來(lái)抗生素在水產(chǎn)品領(lǐng)域產(chǎn)生諸多負(fù)面影響。中草藥、中草藥提取物甚至中藥復(fù)合制劑憑借其毒副作用小、不易引發(fā)耐藥性等特點(diǎn)，得到日益廣泛的重視與研究，如五倍子、黃芩、五味子、苦地膽、黃連、大黃等對(duì)黃顙魚(yú)溫和氣單胞菌的抗菌效果較好[26]，五倍子、穿心蓮、楊樹(shù)花組成的復(fù)方對(duì)黃鱔源嗜水氣單胞菌的抑菌效果較好[27]。本研究中用到3種水產(chǎn)類(lèi)常用的中藥制劑(鹽酸黃連素、四黃抗毒和保肝解毒寧)，其中四黃抗毒和保肝解毒寧對(duì)大鯢希瓦氏菌有一定的抑制作用，但效果均不理想，可能是由于中藥制劑與抗生素的作用機(jī)制不同，相比之下中藥制劑更適于調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能。

綜上所述，本研究中引起大鯢患病的病原為希瓦氏菌，該菌株引起的大鯢疾病可用恩諾沙星進(jìn)行治療。本研究為大鯢的養(yǎng)殖管理提供了參考，并為同批次大鯢的治療提供了可靠的依據(jù)。