夏永華 張彩鳳 李敏 劉冬 胡華 張孟杰 程賽

1新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院皮膚科，河南衛(wèi)輝453100；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南衛(wèi)輝453100

miRNA-373（miR-373）定位于人類染色體 19q13.4，最初被鑒定為人胚胎干細胞特異性miRNA分子之一［1］。隨后研究表明，miRNA-373 的轉(zhuǎn)入能使正常細胞大量增殖并形成腫瘤，且具有癌性大鼠肉瘤病毒癌基因同源基因（rat sarcoma viral oncogene homolog gene，RAS）的特點，被證實為潛在的癌基因［2］。進一步研究顯示，miR-373與食管鱗狀細胞癌（簡稱鱗癌）［3］、宮頸癌［4］、乳腺癌［5］和非小細胞肺癌［6］等多種不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-373 表達下調(diào)顯著抑制皮膚鱗癌A431 細胞的侵襲，并能顯著下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9蛋白的表達［7］。為進一步研究miR-373在皮膚鱗癌中的作用，我們采用miR-373抑制劑下調(diào)皮膚鱗癌細胞中miR-373的表達，探討其對細胞周期和凋亡的影響，初步探討可能的分子機制，為以miR-373為靶點的皮膚鱗癌的靶向治療提供依據(jù)。

一、材料與方法

1.細胞及試劑、儀器：皮膚鱗癌細胞株（A431）來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。miR-373抑制劑（即miR-373互補序列ACACCCCAAAATCGAAGCACTTC）以及陰性對照miRNA為上海吉瑪公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)自美國Invitrogen 公司；胎牛血清產(chǎn)自美國Gibco公司；實時PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均來自北京天根生化科技有限公司；胱天蛋白酶3（caspase-3）檢測試劑盒來自美國Sigma 公司；流式細胞儀為美國Beckman 公司產(chǎn)品；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙錠均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

2.細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組：用含10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素和青霉素的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2環(huán)境中傳代培養(yǎng)A431細胞。細胞處于對數(shù)生長期時，采用胰酶消化，計數(shù)后接種至6 孔板進行后續(xù)實驗。將細胞分為3 組：未處理組不接受任何處理，陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照miRNA，miR-373抑制劑組轉(zhuǎn)染miR-373抑制劑。按照脂質(zhì)體2000的說明操作，于轉(zhuǎn)染后48 h進行后續(xù)實驗。

3.實時PCR檢測細胞中miR-373基因表達：用Trizol試劑提取各組A431 細胞的總RNA，利用miR-373 和U6 反轉(zhuǎn)錄引物按操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄。miR-373 反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTG GATACGACACACCC - 3′ ，U6 反 轉(zhuǎn) 錄 引 物 5′ -GTCGTATCCAG TGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′，均由上海吉凱生物公司合成。按實時PCR 試劑盒說明書擴增細胞中miR-373 基因，并以U6 基因作為內(nèi)參。hsamiR-373-3p正向引物5′-GGGAAGTGCTTCGATTTTG-3′，反向引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6 正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物 5′ -CGCT TCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-△△Ct計算miR-373的相對表達量。

4.CCK-8 檢測細胞增殖：將3 組A431 細胞制備成單細胞懸液，分別接種于96孔板中（3 000個細胞/孔），每個時間點設置 5 個復孔，分別于培養(yǎng) 24、48、72 和 96 h 時在上述培養(yǎng)孔中加入終濃度為10%的CCK-8試劑，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，最后利用酶標儀測定450 nm 波長處吸光度（A值），并繪制腫瘤細胞的生長曲線。

5.細胞周期分析：轉(zhuǎn)染后48 h收集A431細胞，每組1×106個。離心后用預冷的PBS 漂洗3 次，采用70%冰乙醇于4 ℃固定30 min，結束后用預冷的PBS漂洗3次，將細胞重懸于含40 μg碘化丙錠和100 μg RNaseA的PBS中，于37 ℃孵育30 min。最后采用流式細胞儀檢測10 000 個細胞，分析DNA含量。

6.細胞凋亡檢測：收集轉(zhuǎn)染后48 h 的細胞，2 000 r/min（離心半徑1.4 cm）離心5 min，用預冷PBS 漂洗，計數(shù)，按1 × 106/ml 重懸，取100 μl 細胞放置于流式管中，分別加入5 μl 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙錠，避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測10 000 個細胞，最后通過CellQuest軟件分析凋亡率。

7.比色法檢測caspase-3活性：分別將3組A431細胞懸液接種至 96 孔板中，每孔 100 μl（3 × 103個細胞），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染后48 h，根據(jù)試劑盒說明加5 μl 5 mg/L caspase-3 酶底物至上述各組培養(yǎng)基中，37 ℃孵育1 h。酶標儀測定A450值，以此表示caspase-3活性。

二、結果

1.miR-373抑制劑顯著下調(diào)A431細胞中miR-373的表達：實時PCR 檢測表明，miR-373 抑制劑組miR-373 的表達水平為0.120±0.036，顯著低于未處理組（1.002±0.022）和陰性對照組（1.037 ± 0.028），且差異有統(tǒng)計學意義（F=376.565，P＜ 0.001；t值分別為36.21、34.83，均P＜ 0.001）；未處理組和陰性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（t=1.702，P=0.164）。

2.miR-373 表達下調(diào)抑制A431 細胞增殖：與未處理組和陰性對照組相比，miR-373抑制劑組在48、72和96 h時細胞增殖活性顯著降低，且3 組間差異均有統(tǒng)計學意義（F值分別為10.805、13.720 和 30.907，P值分別為0.038，0.010 和0.001），而未處理組和陰性對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義（t值分別為0.614、0.049和0.755，P值分別為0.572、0.963和0.492）。見圖1。

3.miR-373 表達下調(diào)對A431 細胞周期的影響：流式細胞儀檢測結果表明，miR-373抑制劑組G0/G1期比例顯著高于未處理組和陰性對照組，且差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為15.51、13.24，P值分別為0.000 1、0.000 2）S期比例顯著低于未處理組和陰性對照組，且差異有統(tǒng)計學意義（t值分別為18.39、15.76，均P＜ 0.000 1）；G2/M期比例顯著低于未處理組和陰性對照組，差異亦有統(tǒng)計學意義（t值分別為6.216、5.141，P值分別為0.003 4、0.006 8）。未處理組和陰性對照組之間G0/G1期、S期、G2/M期細胞比例差異均無統(tǒng)計學意義（t值分別為1.822、0.821、2.169，P值分別為0.143、0.458、0.096）。見圖2。

4.miR-373表達下調(diào)誘導A431細胞凋亡：miR-373抑制劑組中A431細胞早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡的細胞比例均顯著高于另外兩組（圖3），且3組間差異均具有統(tǒng)計學意義（F值分別為279.369、19.775和135.739，均P＜ 0.01）。未處理組和陰性對照組之間早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡細胞比例差異均無統(tǒng)計學意義（t值分別為0.165、0.354 和0.042，P值分別為0.877、0.741和0.968）。

圖1 miR-373 表達下調(diào)對A431 細胞增殖的影響 a：與未處理組和陰性對照組相比，P ＜0.05

圖2 各組A431細胞周期分布比較 a：與未處理組和陰性對照組相比，均P ＜0.01

圖3 不同處理組A431 細胞早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡細胞比例比較 a：與未處理組和陰性對照組相比，均P ＜0.01

5.miR-373 表達下調(diào)對A431 細胞caspase-3 活性的影響：miR-373 抑制劑組caspase-3 活性為（1.238 ± 0.057），顯著高于未處理組（0.413 ± 0.028）和陰性對照組（0.437 ±0.036），且差異有統(tǒng)計學意義（F=123.392，P＜ 0.05；t值分別為12.87、11.84，P值分別為0.000 2、0.000 3），而未處理組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義（t=0.519，P=0.631）。

三、討論

研究表明，miRNA 介導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控涉及腫瘤調(diào)控中的每一個環(huán)節(jié)，異常miRNA 表達與腫瘤細胞生物學過程密切相關，如凋亡逃避、增殖、轉(zhuǎn)移和化療抗性［8-9］。在這個過程中，一些miRNA 發(fā)揮癌基因的功能，而另一些扮演抑癌基因的作用［10］。類似地，miR-373在不同腫瘤中的作用也不盡相同，如在食管鱗癌［3］、宮頸癌［4］和胃癌［11］等腫瘤中發(fā)揮癌基因的功能，而在膽管癌［12］、結腸癌［13］和胰腺癌［14］等腫瘤中發(fā)揮抑癌基因功能，這可能與其靶向作用的基因不同相關。然而，迄今為止，miR-373在皮膚鱗癌中的功能尚不清楚，為了探討其作用，我們在前期研究中檢測人永生化上皮細胞（HaCaT細胞）和皮膚鱗癌細胞株中miR-373的表達，發(fā)現(xiàn)皮膚鱗癌細胞株中miR-373的表達水平均顯著高于HaCaT細胞［7］，提示miR-373 可能在皮膚鱗癌中發(fā)揮癌基因的功能，因而其可能成為皮膚鱗癌潛在的分子治療靶點。

Tanaka等［13］研究發(fā)現(xiàn)，miR-373的表觀沉默在結腸癌細胞增殖中發(fā)揮抗增殖作用，這種作用可能與調(diào)控癌基因RAB22A的表達相關。此外，miR-373的過表達增加胃癌細胞的增殖潛能，這可能與腫瘤壞死因子α誘導蛋白1的表達水平下調(diào)密切相關，腫瘤壞死因子α誘導蛋白1的過表達可減弱miR-373抑制劑對胃癌細胞的抑制能力［11］。上述研究表明，miR-373在調(diào)控腫瘤增殖中具有重要的價值。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)，miR-373 表達下調(diào)可顯著抑制皮膚鱗癌A431 細胞的增殖，并且提高A431 細胞在G0/G1 期的比例，但降低S 期和G2/M 期細胞比例，提示miR-373 可能在皮膚鱗癌增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用。未來尚需通過實驗進一步證實miR-373 調(diào)控的靶基因在皮膚鱗癌增殖中的作用，從而為miR-373的臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎。

miRNA 與腫瘤細胞凋亡密切相關，有些被鑒定為促凋亡miRNA［15］，而有些發(fā)揮抑制凋亡的作用［16］。為了進一步闡明miR-373 與皮膚鱗癌細胞凋亡的關系，我們采用流式細胞儀分析不同處理組之間細胞凋亡的變化。結果顯示，抑制miR-373表達顯著誘導細胞凋亡，提示miR-373在皮膚鱗癌中屬于抗凋亡的miRNA分子。進一步研究表明，miR-373表達下調(diào)與caspase-3 活性升高密切相關，這可能是miR-373引發(fā)皮膚鱗癌細胞凋亡的可能分子機制。

總之，本研究結果表明，miR-373 表達下調(diào)可顯著抑制皮膚鱗癌細胞的增殖，改變細胞周期分布和誘導細胞凋亡，其凋亡誘導作用可能與caspase-3活性升高有關。這些研究初步提示，miR-373可能在調(diào)控皮膚鱗癌細胞增殖、周期和凋亡中發(fā)揮關鍵作用，未來miR-373 可能成為皮膚鱗癌潛在的分子治療靶點。本研究盡管提示miR-373在皮膚鱗癌中的初步作用，但尚需進一步闡明miR-373 在皮膚鱗癌中的靶點，從機制上闡明其在皮膚鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為以miR-373為靶點的治療奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突