張夢珂 戚元成 文 晴 邱立友 申進文

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002）

糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus），又稱平菇，廣泛分布于世界各地，其肉質(zhì)肥厚、味道鮮美，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]。平菇經(jīng)擔(dān)孢子萌發(fā)形成單核菌絲，單核菌絲接合而成雙核菌絲，當(dāng)環(huán)境條件適宜時，雙核菌絲扭結(jié)形成原基進而發(fā)育成熟形成子實體[2-3]。糙皮側(cè)耳雙核菌絲誘發(fā)形成原基進而發(fā)育成熟為子實體受到各種環(huán)境因素的影響，如光、溫度、濕度、二氧化碳[4]和培養(yǎng)料碳氮比，這些條件共同作用誘導(dǎo)菌絲體形成原基發(fā)育成子實體，但原基誘發(fā)和子實體的發(fā)育機制還沒有得到完全解析。

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的“第二信使”[5]，在原核及真核細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)多種胞外刺激，調(diào)節(jié)生物生長發(fā)育[6]。在生物體內(nèi)，cAMP誘導(dǎo)的真核基因表達與蛋白激酶A（PKA）的激活緊密相關(guān)，一方面cAMP水平的升高可以激活PKA，另一方面PKA又可以磷酸化某些特定的轉(zhuǎn)錄因子，促進cAMP誘導(dǎo)的基因表達[7]。敲除裂褶菌蛋白激酶A（PKA）和腺苷酸環(huán)化酶編碼基因，能引起突變株的子實體產(chǎn)量降低或子實體發(fā)育異常。cAMP信號涉及真菌的很多細(xì)胞過程，如細(xì)胞生長、新陳代謝、形態(tài)發(fā)生、脅迫響應(yīng)和病原真菌的侵染能力等[8]。在擔(dān)子菌中，cAMP可以誘導(dǎo)灰蓋鬼傘的單核體菌株產(chǎn)生子實體，阻止cAMP的合成延緩雙核菌絲體扭結(jié)形成原基，以高濃度的葡萄糖抑制cAMP的累積從而抑制原基的產(chǎn)生[9]。研究通過分析外源性cAMP對糙皮側(cè)耳菌絲生長及原基形成的影響，旨在為進一步從分子水平解析糙皮側(cè)耳原基形成過程中cAMP的作用機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

糙皮側(cè)耳新831，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用真菌實驗室保藏。

蔗糖天冬酰胺合成培養(yǎng)基（SA，固體培養(yǎng)基）：蔗糖 20 g，天冬酰胺 0.88 g，磷酸二氫銨 2.0 g，L-纈氨酸1.0 g，三水磷酸氫二鉀0.224 g，磷酸二氫鉀0.803 g，七水硫酸鎂0.99 g，氯化鈣0.02 g，微量元素溶液5 mL，維生素核苷酸溶液5 mL，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL。微量元素溶液：七水硫酸鋅0.89 g，硫酸錳0.765 g，檸檬酸鐵0.73 g，五水硫酸銅0.20 g，蒸餾水1000 mL。維生素核苷酸溶液：腺苷1.60 g，維生素B10.02 g，蒸餾水1000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度的cAMP對糙皮側(cè)耳菌絲生長及原基形成的影響

將外源添加藥品按添加濃度現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾除菌后備用，添加濃度 0mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L，SA培養(yǎng)基融化冷卻到約60℃時，加入相應(yīng)濃度cAMP混勻后制平板。將活化后的新831菌絲，用打孔器打取直徑5 mm的邊緣菌絲塊，菌絲正面朝上接入制備好的固體平板培養(yǎng)基中央，在25℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。待某個處理的菌絲滿板時，測定糙皮側(cè)耳菌絲生長速度，隨后10℃恒溫培養(yǎng)箱光照黑暗交替（8 h光照、16 h黑暗）培養(yǎng)18 d，記錄原基形成情況（拍照），并測定相應(yīng)蛋白濃度。每個濃度10個板，三次重復(fù)。

1.2.2 菌絲平均長速的測定

參照1.2.1生物接種方法接種，25℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，待某個處理的菌絲滿板時即結(jié)束培養(yǎng)。通過十字交叉法測定菌絲生長長度（mm），并計算出菌絲平均生長速度。

菌絲平均生長速度（mm/d）=菌絲生長長度（mm）/培養(yǎng)天數(shù)（d）

1.2.3 蛋白濃度的測定

蛋白含量測定原理：蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸可與考馬斯亮藍(lán)G250染料結(jié)合，使考馬斯亮藍(lán)G250染色液由黑棕色變?yōu)樗{(lán)色，并且生成的藍(lán)色產(chǎn)物在595 nm處有最大吸收峰值。因此，通過測定反應(yīng)液的OD595值，并帶入蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出溶液中的蛋白濃度。

（1）蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法：根據(jù)蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）的操作說明測定不同蛋白濃度下的OD595值，如表1所示。

表1 蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

（2）蛋白濃度測定方法：取5 μL待測液至酶標(biāo)管內(nèi)，之后加入200 μL考馬斯亮藍(lán)G250染色液，室溫放置10 min，測定OD595值。將OD595值代入蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線所示標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中，計算出待測液中的蛋白濃度。

1.2.4 cAMP對糙皮側(cè)耳PKAC-1和PKAC-2基因表達量的影響

根據(jù)上述試驗結(jié)果，選取cAMP1mmol/L的添加濃度制備平板，同時把cAMP 0mmol/L作為空白對照，將糙皮側(cè)耳新831接種于平板中央。培養(yǎng)條件：25℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，待菌絲滿板，隨后10℃恒溫培養(yǎng)箱光照黑暗交替（8 h光照、16 h黑暗）培養(yǎng)4 d、8 d、12 d、16 d、20 d，每個培養(yǎng)時間3個板，三次重復(fù)。Trizol法提取不同時間總RNA，取1 μg總RNA樣品，參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明合成cDNA的第一條鏈，選取糙皮側(cè)耳actin為內(nèi)參基因，參照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明，實時熒光定量分析在不同培養(yǎng)時間添加cAMP與空白對照組糙皮側(cè)耳PKAC-1和PKAC-2的差異表達。qRT-PCR反應(yīng)體系為：10 μL SYBR Green Master Mix，上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），1 μLcDNA，7.4 μL ddH2O。循環(huán)參數(shù)設(shè)定為：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，60℃25 s，共40個循環(huán)，3次重復(fù)。反應(yīng)在applied 7500實時熒光定量PCR儀上進行，利用2-ΔΔCT的方法計算目的基因相對表達量。試驗所需引物如下：PKAC-1熒光定量-F TCTGTCGATCCCCAAATGCC，PKAC-1熒光定量-R GCGTACCCTTGACCTCGAAA，PKAC-2熒光定量-FATTGTTCACGCTGCTACGGA，PKAC-2熒光定量-RTCAGGCTTGAGGTCCCGATA。

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析（LSD，P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳（新831）菌絲長速的影響

不同cAMP濃度對糙皮側(cè)耳菌絲平均長速的影響見圖1。在測試濃度范圍內(nèi)，隨著cAMP濃度的增加，糙皮側(cè)耳菌絲平均長速先快后慢，cAMP添加濃度為1 mmol/L時菌絲平均長速達到最大值，cAMP添加濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L能顯著提高糙皮側(cè)耳菌絲平均生長速度（P＜0.05），添加cAMP濃度繼續(xù)升高，對菌絲生長出現(xiàn)抑制作用，但抑制效果不顯著。

圖1 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳（新831）菌絲長速的影響

2.2 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳（新831）原基形成的影響

不同cAMP濃度對糙皮側(cè)耳（新831）菌絲原基形成的影響見圖2。10℃恒溫培養(yǎng)箱光照黑暗交替（8 h光照、16 h黑暗）培養(yǎng)18 d后，未添加cAMP的空白對照組，未見原基形成；cAMP添加濃度為1 mmol/L時明顯可見原基形成；添加濃度為2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L時，平板中可見菌絲扭結(jié)，且隨著添加濃度的升高，菌絲扭結(jié)越少；其他cAMP添加濃度與對照組沒有差異。

圖2 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳（新831）菌絲原基形成的影響

2.3 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳（新831）菌絲蛋白含量的影響

將上述1.2.1所得添加不同濃度cAMP培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，按照蛋白濃度測定方法，測定菌絲蛋白含量。結(jié)果表明，在試驗濃度范圍內(nèi)，與空白對照組相比，cAMP顯著降低糙皮側(cè)耳菌絲的蛋白含量（P＜0.05）；cAMP添加濃度為1 mmol/L時，菌絲蛋白含量最低；cAMP添加濃度為2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L時，菌絲蛋白含量略微提高，但仍顯著低于空白對照組（P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同濃度cAMP對糙皮側(cè)耳（新831）菌絲蛋白含量的影響

2.4 外源性cAMP對糙皮側(cè)耳（新831）PKAC-1和PKAC-2表達量的影響

由圖4可見，與對照組相比PKAC-1相對表達量整體下調(diào)，其中培養(yǎng)4 d后PKAC-1相對表達量下調(diào)顯著（P＜0.05），其他與對照組之間不存在顯著性差異；培養(yǎng)時間8 d、12 d、20 d時，加cAMP組與不加cAMP相比PKAC-2的相對表達量整體上調(diào)，且在培養(yǎng)12 d時cAMP顯著提高PKAC-2的相對表達量（P＜0.05）。

圖4cAMP對PKAC-1、PKAC-2相對表達量的影響

3 小結(jié)與討論

研究結(jié)果表明，cAMP對糙皮側(cè)耳（新831）菌絲生長影響顯著，適宜濃度的外源cAMP顯著促進糙皮側(cè)耳菌絲生長，但高濃度的外源cAMP抑制菌絲生長，cAMP對糙皮側(cè)耳菌絲生長的影響與對其他一些真菌的效應(yīng)相同。2007年，HU等發(fā)現(xiàn)較高濃度的外源cAMP抑制水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani AG－1IA分離物的菌絲生長[10]。OLIVER等2002年發(fā)現(xiàn)高濃度的外源cAMP抑制致病真菌煙曲霉Aspergillus fumigatus的菌絲生長[11]。

cAMP添加濃度1 mmol/L能顯著縮短光誘導(dǎo)糙皮側(cè)耳（新831）原基形成所需時間。綠色木霉中的光誘導(dǎo)伴隨著細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的突然短暫升高[12]，磷酸二酯酶抑制劑對光誘導(dǎo)的分生孢子形成有促進作用[13]。1998年，NEMCOVIC等發(fā)現(xiàn)cAMP在調(diào)節(jié)木霉菌分生孢子形成過程中起著關(guān)鍵作用[14]。對白色念珠菌的研究發(fā)現(xiàn)，刺激腺苷酸環(huán)化酶生成cAMP能誘導(dǎo)其菌絲形態(tài)發(fā)育，腺苷酸環(huán)化酶等位基因極度活躍或外源cAMP的添加能促進白色念珠菌菌絲發(fā)育[15]，而腺苷酸環(huán)化酶缺失菌株（cyr1△）在菌絲發(fā)育方面存在缺陷[16]，說明cAMP對于白色念珠菌的菌絲發(fā)育必不可少[17]。

2006年，ALFREDO等對綠色木霉的研究發(fā)現(xiàn)，在綠色木霉的分生孢子形成過程伴隨著PKA活性的升高[18]。實時熒光定量PCR分析cAMP添加后糙皮側(cè)耳（新831）PKAC-1和PKAC-2基因在不同培養(yǎng)時間的差異表達結(jié)果表明，添加cAMP對糙皮側(cè)耳PKAC-1和PKAC-2基因的表達量有一定影響，處理組與對照組相比，PKAC-1表達量差異不顯著，但PKAC-2表達量在培養(yǎng)12 d時顯著上調(diào)，表明cAMP可能通過上調(diào)PKAC-2基因的表達量來提高蛋白激酶活性，從而加速原基形成。

添加外源cAMP對糙皮側(cè)耳原基的形成可能起到了一定作用，研究結(jié)果對探究糙皮側(cè)耳原基形成的分子機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。