郭敏，趙子雅，王瑞寧，鄭曉寧，彭永東，劉錚鑄，李祥龍，鞏元芳

北極狐β-防御素103基因()啟動(dòng)子活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析

郭敏1，趙子雅1，王瑞寧1，鄭曉寧2，彭永東1，劉錚鑄1，李祥龍1，鞏元芳1

1 河北科技師范學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 秦皇島 066004 2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000

本研究旨在篩選調(diào)控北極狐毛色基因的啟動(dòng)子活性區(qū)域及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，為揭示基因調(diào)控北極狐毛色形成的分子遺傳機(jī)制提供依據(jù)。克隆獲得了北極狐基因5′側(cè)翼區(qū)2 123 bp的片段，并構(gòu)建了4個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子缺失片段表達(dá)載體，通過(guò)雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)啟動(dòng)子活性最高區(qū)域預(yù)測(cè)出的3個(gè)特異性蛋白1 (Sp1) 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分別進(jìn)行點(diǎn)突變并構(gòu)建3個(gè)突變載體，利用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定其活性。結(jié)果顯示，在構(gòu)建的4個(gè)不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子缺失片段中1 656 (?1 604/+51) 區(qū)域活性最高，在此區(qū)域構(gòu)建的3個(gè)突變載體的啟動(dòng)子活性較野生型 (片段1 656) 均顯著降低，說(shuō)明?1 604/+51區(qū)域?yàn)楸睒O狐基因的核心啟動(dòng)子區(qū)，?1 552/?1 564、?1 439/?1 454和?329/?339區(qū)域?yàn)檎{(diào)控區(qū)域。文中成功獲得了北極狐基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域和正調(diào)控區(qū)域，這為進(jìn)一步研究該基因調(diào)控北極狐被毛顏色分子遺傳機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

北極狐，基因，啟動(dòng)子活性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件

多彩的毛皮不僅是動(dòng)物在自然選擇下所遺留的成果，更為動(dòng)物界增添了靚麗。毛色作為一種重要的表型遺傳標(biāo)記，在確定品種純度、親緣關(guān)系等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時(shí)對(duì)毛皮品質(zhì)也有著重要的影響[1-2]。黑色素是位于動(dòng)物表層結(jié)構(gòu)中最重要的色素[3-4]。防御素 (Defensins) 是一種陽(yáng)離子抗菌肽，根據(jù)其空間結(jié)構(gòu)的不同可分為α、β和θ防御素[5]；其中β-防御素103基因主要在哺乳動(dòng)物上皮組織中表達(dá)，其編碼的防御素是富含精氨酸殘基的分泌型多肽。哺乳動(dòng)物基因通常含有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，第一個(gè)外顯子編碼5′端非編碼序列、信號(hào)序列和部分前導(dǎo)序列，第二個(gè)外顯子編碼剩余前導(dǎo)序列、3′端非編碼序列以及成熟肽[6]?；蛟谝恍┎溉閯?dòng)物毛色類型轉(zhuǎn)換的相關(guān)研究中表現(xiàn)出重要作用，該基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)與基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)相似，其蛋白產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MC1R且親和力極高，可改變黑色素合成通路，最終改變動(dòng)物的毛色[7]。這一結(jié)果拓展了對(duì)β-防御素作用的認(rèn)識(shí)，其不僅對(duì)哺乳動(dòng)物具有免疫作用[8]，還可通過(guò)黑皮質(zhì)素受體信號(hào)最終改變動(dòng)物毛色，成為毛色調(diào)控的候選基因。在基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中起“總指揮”作用的啟動(dòng)子具有決定轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控基因表達(dá)的功能[9]。目前尚未見(jiàn)北極狐基因調(diào)控毛色的報(bào)道。本研究利用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析[10-11]等方法對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)及調(diào)控元件進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，探明該基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域及重要的調(diào)控元件，為深入探究該基因?qū)Ρ睒O狐毛色形成的調(diào)控作用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北極狐皮膚組織樣品取自河北省秦皇島市昌黎縣金島育種場(chǎng)。LADNA Polymerase、pMD19-T Vector、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和T4 DNA連接酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；2×TransStart FastPCR SuperMix和TransStartDNA Polymerase購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑盒、胰蛋白酶、限制性內(nèi)切酶、血清、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑及Opti-MEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司 (美國(guó))；質(zhì)粒DNA小量提取抽提試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA大量提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司；D-PBS和DMEM培養(yǎng)基 (高糖型) 購(gòu)自Hyclone公司 (美國(guó))[12]。本實(shí)驗(yàn)室保藏有人惡性黑色素瘤細(xì)胞系 (A375)、人腎上皮細(xì)胞系 (293T)、質(zhì)粒載體pRL-TK和pGL3-Basic。

1.2 北極狐CBD103基因啟動(dòng)子的克隆擴(kuò)增

課題組前期擴(kuò)增獲得北極狐基因序列2 327 bp (包括5′側(cè)翼區(qū)2 071 bp、CDS區(qū) 204 bp、3′側(cè)翼區(qū)52 bp)，并利用生物信息學(xué)的方法對(duì)啟動(dòng)子區(qū)及調(diào)控元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)[13]。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，選取起始密碼子上游2 000 bp左右的序列作為候選啟動(dòng)子區(qū)并設(shè)計(jì)引物 (表1)，PCR擴(kuò)增4個(gè)缺失片段 (圖1)。。使用Primer Premier 5.0分析限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增體系 (50 μL)：其中基因組DNA 1 μL，10×PCR緩沖液 (Mg2+Plus) 5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 8 μL，上游引物 (20 μmol/L) 1 μL，下游引物 (20 μmol/L) 1 μL，LADNA聚合酶 (5 U/μL) 0.5 μL，滅菌ddH2O 33.5 μL。使用JASPAR、AliBaba 2.1、Nsite、Cluster和Signal SCAN在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn) (表2)。

表1 本文中使用的引物

Note: the underlined and thickened bases represent restriction sites and mutant bases, respectively.

圖1 北極狐CBD103基因預(yù)測(cè)啟動(dòng)子片段

1.3 構(gòu)建及鑒定缺失片段報(bào)告載體

將不同缺失片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD19-T載體中構(gòu)建重組克隆載體pMD19-X。經(jīng)過(guò)菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的樣品送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序。重組克隆載體pMD19-X及pGL3-Baisc載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，將回收產(chǎn)物連接至pGL3-Baisc中構(gòu)建pGL3-Baisc-X重組報(bào)告載體。

1.4 構(gòu)建及鑒定突變載體

分別以1656F和Mut-Sp1-1-R、Mut-Sp1-1-F和R、1656F和Mut-Sp1-2-R、Mut-Sp1-2-F和R、1656F和Mut-Sp1-3-R、Mut-Sp1-3-F和R為引物 (表1)，以pGL3-Baisc-1656質(zhì)粒為模板，通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增上下游產(chǎn)物。重疊延伸PCR擴(kuò)增體系 (40 μL)：野生型質(zhì)粒模板2 μL，2×Super Mix 20 μL，上下游引物 (20 μmol/L) 各1 μL，滅菌ddH2O 16 μL；將上述擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行回收并進(jìn)行等比例混合，用此混合物為模板，以引物1656F和R擴(kuò)增突變載體全長(zhǎng)片段，PCR擴(kuò)增體系 (50 μL)：其中混合物模板2.5 μL，10×TransStart緩沖液 5 μL，TransStartDNA聚合酶0.5 μL，dNTP Mixture (10 mmol/L) 1 μL，上下游引物 (20 μmol/L) 各1 μL，滅菌ddH2O 39 μL。

1.5 雙熒光素酶活性鑒定

利用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體分別將熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Baisc-X和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK一起轉(zhuǎn)染至293T和A375細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)基因啟動(dòng)子活性進(jìn)行檢測(cè)。使用發(fā)光儀檢測(cè)pGL3質(zhì)粒中螢火蟲熒光素酶活性，讀出數(shù)值為F，檢測(cè)pRL-TK質(zhì)粒中海腎熒光素酶活性，讀出數(shù)值為R。用F/R的值代表基因啟動(dòng)子相對(duì)活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 24.0軟件中的單因素方差分析對(duì)不同檢測(cè)片段的啟動(dòng)子活性數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，<0.05表示差異顯著性，<0.01表示差異極顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 北極狐CBD103基因啟動(dòng)子缺失載體的擴(kuò)增

以基因組DNA為模板，對(duì)北極狐基因候選啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行不同缺失片段的擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出片段1?4∶2 123 bp (?2 017/+51)、1 656 bp (?1 604/+51)、1 178 bp (?1 126/+51) 和559 bp (?507/+51)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，擴(kuò)增出的條帶大小與預(yù)期相一致。

表2 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)網(wǎng)站

圖2 北極狐CBD103基因啟動(dòng)子缺失片段PCR產(chǎn)物凝膠電泳

2.2 北極狐CBD103基因啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建

使用T4 DNA連接酶將雙酶切后的片段連接到pGL3-Basic質(zhì)粒上，將構(gòu)建完成的熒光素酶表達(dá)載體進(jìn)行鑒定 (圖3和圖4)。

2.3 北極狐CBD103基因5′端序列的活性分析

將啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)載體質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至A375和293T細(xì)胞中，檢測(cè)雙熒光素酶活性 (圖5)，結(jié)果顯示4個(gè)啟動(dòng)子缺失片段熒光素酶表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞的活性值高低趨勢(shì)一致；除報(bào)告基因2 123 (–2 071/+51) 與pGL3-basic對(duì)照組相比差異顯著 (0.05) 外，其他3個(gè)啟動(dòng)子片段的活性與對(duì)照組比較均差異極顯著 (0.01)；報(bào)告基因1 656 (?1 604/+51) 在兩種細(xì)胞間的活性均最高，且與其他3個(gè)片段活性相比，均差異極顯著 (0.01)，表明該區(qū)域?yàn)樵摶虻暮诵膯?dòng)子區(qū)域。

圖3 北極狐CBD103基因熒光素酶表達(dá)載體PCR產(chǎn)物凝膠電泳

圖4 北極狐CBD103基因熒光素酶表達(dá)載體雙酶切產(chǎn)物凝膠電泳

圖5 北極狐CBD103基因啟動(dòng)子表達(dá)載體相對(duì)熒光素酶活性值

2.4 北極狐CBD103基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

利用多種轉(zhuǎn)錄因子在線分析網(wǎng)站對(duì)核心啟動(dòng)子區(qū) (?1 604/+51) 的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，為了提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，綜合考慮至少2個(gè)預(yù)測(cè)網(wǎng)站的結(jié)果 (表3)，分析結(jié)果表明在?1 552/?1 564、?1 439/?1 454和?329/?339位置存在Sp1結(jié)合位點(diǎn)。

2.5 北極狐CBD103基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Sp1突變體活性分析

以pGL3-Baisc-1656為模板對(duì)預(yù)測(cè)的3個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)分別進(jìn)行點(diǎn)突變 (圖6)，通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增上下游引物并構(gòu)建突變載體 (圖7)，突變前后序列對(duì)比見(jiàn)表4，分別將pGL3-Baisc-1656載體和突變載體轉(zhuǎn)染至A375和293T細(xì)胞中，并對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，相比于野生型載體1656 (?1 604/+51)，3個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)突變后的載體啟動(dòng)子活性均極顯著下降 (0.01) (圖8)。

表3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

圖6 北極狐CBD103基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變

圖7 北極狐CBD103基因啟動(dòng)子突變體的擴(kuò)增

表4 北極狐CBD103基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變前后比較

Note: the underlined and thickened bases represent mutant bases.

圖8 北極狐CBD103基因突變啟動(dòng)子表達(dá)載體相對(duì)熒光素酶活性值

3 討論

狐皮被稱為世界毛皮產(chǎn)業(yè)三大臺(tái)柱之一，其毛色性狀[14]將直接影響皮張品質(zhì)和其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。動(dòng)物毛色的形成主要受遺傳因素控制，基因調(diào)控動(dòng)物毛色形成的機(jī)理十分復(fù)雜[15]。啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，就像“開關(guān)”決定基因的活動(dòng)，其克隆方式也越來(lái)越多，大致分為基因組文庫(kù)篩選法、利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子法和基于PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子法等，這些技術(shù)在生物實(shí)驗(yàn)中得到了不同程度的應(yīng)用[16]。研究表明克隆片段若僅含有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游區(qū)域易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，可選擇包含TSS、ATG及部分CDS區(qū)來(lái)提高陽(yáng)性率[17]。本研究克隆獲得了北極狐基因啟動(dòng)子序列，構(gòu)建了4個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子缺失片段表達(dá)載體，通過(guò)雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子活性，以確定啟動(dòng)子的功能序列位置。經(jīng)檢測(cè)確定?1 604/+51區(qū)域?yàn)楸睒O狐基因的核心啟動(dòng)子區(qū)，同時(shí)對(duì)此區(qū)域的調(diào)控元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該區(qū)域存在3個(gè)Sp1 (?329/?339；?1 439/?1 454；?1 552/?1 564) 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。現(xiàn)已在壩上長(zhǎng)尾雞基因[18]，北極狐、水貂基因[19-20]，壩上長(zhǎng)尾雞、北極狐、山羊、水貂基因[21-24]中的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)存在Sp1這一轉(zhuǎn)錄因子。Sp1已被證實(shí)是一種能影響轉(zhuǎn)錄起始的反式激活子[25]。啟動(dòng)子中存在多種順式作用元件參與基因的轉(zhuǎn)錄，如CAAT框、TATA框和GC框等。CAAT框是真核生物基因中普遍存在的調(diào)控區(qū)，控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率[26]；TATA決定基因轉(zhuǎn)錄起始的選擇，并能影響轉(zhuǎn)錄的速率；GC框主要分布在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前?128/?23 bp區(qū)域內(nèi)，一般位于CAAT框的兩側(cè)和TATA框上游，能夠結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白Sp1[27]。有學(xué)者指出，某基因中CAAT框若存在于TATA框上游，則該基因的表達(dá)量將出現(xiàn)大幅提升[28]。對(duì)北極狐基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因在同一區(qū)域存在GC框 (?1 560) 和Sp1 (?1 552/?1 564) 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)GC框可能與轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，為北極狐基因核心啟動(dòng)子區(qū)的確定提供參考。研究發(fā)現(xiàn)Sp1的抑制表達(dá)能夠顯著降低豬成肌細(xì)胞中啟動(dòng)子活性，Sp1通過(guò)GC框?qū)ωi成肌細(xì)胞分化過(guò)程中基因的轉(zhuǎn)錄激活起正調(diào)控作用[29]。田宏攀[30]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Sp1對(duì)基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄激活的控制受到DNA甲基化的影響，Sp1可以增強(qiáng)無(wú)甲基化和部分甲基化的基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，對(duì)完全甲基化的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性無(wú)影響。3個(gè)Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的突變 (?1 552/?1 564、?1 439/?1 454和?329/?339) 都能夠使得北極狐基因啟動(dòng)子的活性顯著下降，推斷以上3個(gè)Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)為北極狐基因的正調(diào)控區(qū)域。為了進(jìn)一步探究轉(zhuǎn)錄因子Sp1與北極狐基因之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系，接下來(lái)可利用染色質(zhì)免疫共沉淀 (ChIP) 和凝膠遷移實(shí)驗(yàn) (EMSA) 進(jìn)行驗(yàn)證，并與其他毛色調(diào)控基因啟動(dòng)子序列中的轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的具體作用做對(duì)比以發(fā)現(xiàn)這其間的共性，為進(jìn)一步探究動(dòng)物毛色的調(diào)控機(jī)制做鋪墊。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了4個(gè)包含北極狐基因5′端不同長(zhǎng)度缺失啟動(dòng)子片段的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，確定了?1 604/+51區(qū)域?yàn)楸睒O狐基因的啟動(dòng)子區(qū)；通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)出?1 552/?1 564、?1 439/?1 454和?329/?339處存在Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并對(duì)以上3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變和活性檢測(cè)，結(jié)果顯示以上3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合位點(diǎn)為北極狐基因的正調(diào)控區(qū)域。

[1] Zhang JZ, Dong CS, Fan RW, et al. Advance in pigment melanin of mammalian. Progr Vet Med, 2006, 27(S1): 65–68 (in Chinese). 張俊珍, 董常生, 范瑞文, 等. 哺乳動(dòng)物毛色形成研究進(jìn)展. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2006, 27(S1): 65–68.

[2] Xu GL, Liu ZZ, Gong YF, et al. Research progress on the controlling genes for the coat colors of fur animals. Heilongjiang Anim Sci Vet Med, 2015, (13): 52–54 (in Chinese). 徐桂利, 劉錚鑄, 鞏元芳, 等. 毛皮動(dòng)物毛色調(diào)控基因的研究進(jìn)展. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2015, (13): 52–54.

[3] Krauss J, Geiger-Rudolph S, Koch I, et al. A dominant mutation inleads to melanophore death in zebrafish. Pigment Cell Melanoma Res, 2014, 27(5): 827–830.

[4] Ollmann MM, Lamoreux ML, Wilson BD, et al. Interaction of Agouti protein with the melanocortin 1 receptorand. Genes Dev, 1998, 12(3): 316–330.

[5] Wang W, Cole AM, Hong T, et al. Retrocyclin, an antiretroviral the θ-defensin, is a lectin. J Immunol, 2003, 170(9): 4708–4716.

[6] Lehrer RI, Ganz T. Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence. Curr Opin Immunol, 1999, 11(1): 23–27.

[7] Candille SI, Kaelin CB, Cattanach BM, et al. A β-defensin mutation causes black coat color in domestic dogs. Science, 2007, 318(5855): 1418–1423.

[8] Jin X, Zhang M, Fan YR, et al. The role of β- defensin in the process of infection and inflammation. Heilongjiang Anim Sci Vet Med, 2015(13): 55–57 (in Chinese). 金鑫, 張曼, 范燕茹, 等. β-防御素在感染和炎癥過(guò)程中的作用. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2015(13): 55–57.

[9] Li SY, Lang ZH, Huang DF. Research progress on eukaryotic promoter. Curr Biotechnol, 2014, 4(3): 158–164 (in Chinese). 李圣彥, 郎志宏, 黃大昉. 真核生物啟動(dòng)子研究概述. 生物技術(shù)進(jìn)展, 2014, 4(3): 158–164.

[10] Long X, Chai J, Zhao JG, et al. Cloning, transcriptional activity and regulatory elements analysis of porcine EIF2S3 gene promoter. Acta Agric Bor-Sin, 2018, 33(S1): 38–44 (in Chinese). 龍熙, 柴捷, 趙久剛, 等. 豬EIF2S3基因啟動(dòng)子的克隆、活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2018, 33(S1): 38–44.

[11] Ma TF, Wang JY, Hou JC, et al. Regulating role of hsa-miR-4443 in expression of TIMP2 detected by dual-luciferase reporter system. Acta Med Univ Sci Technol Huazhong, 2018, 47(3): 269–273 (in Chinese). 馬騰飛, 王金焱, 侯俊宸, 等. 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定hsa-miR-4443對(duì)TIMP2基因的調(diào)控作用. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2018, 47(3): 269–273.

[12] Guo M. Study on promoter activity of fox fur gene、and[D]. Qinhuangdao: Hebei Normal University of Science Technology, 2018. (in Chinese)郭敏. 狐貍毛色基因TYR、CBD103、MITF啟動(dòng)子活性探究[D]. 秦皇島：河北科技師范學(xué)院, 2018.

[13] Guo M, Niu D, Liu YJ, et al. Bioinformatics analysis and promoter prediction on CBD103 gene in Arctic fox. Heilongjiang Anim Sci Vet Med, 2018, (1): 52–56 (in Chinese). 郭敏, 牛迪, 劉艷軍, 等. 北極狐CBD103基因序列生物信息學(xué)分析及啟動(dòng)子預(yù)測(cè). 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2018, (1): 52–56.

[14] Ghosh TC, Gupta SK, Majumdar S. Studies on codon usage in. Int J Parasitol, 2000, 30(6): 715–722.

[15] Suzuki H. Evolutionary and phylogeographic views onandvariation in mammals. Genes Genet Syst, 2013, 88(3): 155–164.

[16] Tang F, Tu HZ. Advances in eukaryotic promoter. China Forest Sci Technol, 2015, 29(2): 7–12 (in Chinese).湯方, 涂慧珍. 真核啟動(dòng)子研究進(jìn)展. 林業(yè)科技開發(fā), 2015, 29(2): 7–12.

[17] Hou DF, Guan YJ, Guan R, et al. Cloning of human NPCEDRG core promoter and preliminary identification of its CCAAT/NFY binding site. Progr Biochem Biophys, 2011, 38(8): 713–723 (in Chinese). 侯德富, 關(guān)勇軍, 關(guān)瑞, 等. 人NPCEDRG基因啟動(dòng)子的克隆及CCAAT/NFY結(jié)合位點(diǎn)初步分析. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2011, 38(3): 713–723.

[18] Liu XH, Zhou RY, Zhang CS, et al. Identification of the core promoter and SNPs analysis of TYR gene in Bashang long-tail chicken (). J Agricul Biotechnol, 2018, 26(6): 959–969 (in Chinese). 劉小輝, 周榮艷, 張傳生, 等. 壩上長(zhǎng)尾雞TYR基因核心啟動(dòng)子鑒定與單核苷酸多態(tài)性分析. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2018, 26(6): 959–969.

[19] Zheng XN, Wang RN, Wang YQ, et al. Promoter and transcription regulatory region in fox TYRP1 gene. Chin J Vet Sci, 2018, 38(12): 2366–2373 (in Chinese). 鄭曉寧, 王瑞寧, 王亞琪, 等. 北極狐TYRP1基因啟動(dòng)子活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域分析. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2018, 38(12): 2366–2373.

[20] Li LS, Li LH, Li XL, et al. Promoter activity and Sp1 binding sites of mink TYRP1 gene. Chin J Vet Sci, 2018, 38(5): 991–997 (in Chinese). 李麗莎, 李蘭會(huì), 李祥龍, 等. 水貂TYRP1基因啟動(dòng)子活性和Sp1結(jié)合位點(diǎn). 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2018, 38(5): 991–997.

[21] Liu XH, Zhou RY, Peng YD, et al. Identification of the core promoter of thegene of Bashang long-tail chickens. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1750–1759 (in Chinese). 劉小輝, 周榮艷, 彭永東, 等. 壩上長(zhǎng)尾雞基因核心啟動(dòng)子的鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(11): 1750–1759.

[22] Zheng XN, Wang YQ, Wang RN, et al. Activity and regulatory region analysis ofgene promoter in. J Agric Biotechnol, 2018, 26(8): 1351–1360 (in Chinese). 鄭曉寧, 王亞琪, 王瑞寧, 等. 北極狐PMEL基因啟動(dòng)子活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域研究. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2018, 26(8): 1351–1360.

[23] Li LS, Peng YD, Zheng XN, et al. Analysis of the promoter activity and transcriptional regulatory elements of goat PMEL gene. Chin J Anim Vet Sci, 2017, 48(5): 826–835 (in Chinese). 李麗莎, 彭永東, 鄭曉寧, 等. 山羊PMEL基因啟動(dòng)子活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2017, 48(5): 826–835.

[24] Li LS, Li LH, Li XL, et al. Analysis of the promoter activity and transcriptional regulatory elements of PMEL gene in mink. J Agricul Biotechnol, 2017, 25(6): 911–920 (in Chinese). 李麗莎, 李蘭會(huì), 李祥龍, 等. 水貂PMEL基因啟動(dòng)子活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2017, 25(6): 911–920.

[25] Zhang X, Luo J, Li JH, et al. Cloning and activity determination of fatty acid synthase (FAS) gene promoter of Xinong Saanen Dairy Goat. Sci Agric Sin, 2010, 43(3): 640–647 (in Chinese). 張曉, 羅軍, 李建華, 等. 西農(nóng)薩能奶山羊脂肪酸合酶基因啟動(dòng)子的克隆及活性測(cè)定. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43(3): 640–647.

[26] Wang Y, Mai WJ, Liang CY, et al. Advances on studies of plant promoters. Acta Bot Bor-Occid Sin, 2003, 23(11): 2040–2048 (in Chinese). 王穎, 麥維軍, 梁承鄴, 等. 高等植物啟動(dòng)子的研究進(jìn)展. 西北植物學(xué)報(bào), 2003, 23(11): 2040–2048.

[27] Du XX, Gao XG, Chen PH, et al. Research on gene promoter of fish. Biotechnol Bull, 2013, (8): 12–16 (in Chinese). 杜小溪, 高祥剛, 陳潘海, 等. 魚類基因啟動(dòng)子的研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2013, (8): 12–16.

[28] Sreenivasulu G, Senthilkumaran B, Sudhakumari CC, et al. 20 β-hydroxysteroid dehydrogenase gene promoter: potential role for cyclic AMP and xenobiotic responsive elements. Gene, 2012, 509(1): 68–76.

[29] Xiong Q, Chai J, Zhang N, et al. Role of transcription factors Sp1 in the expressional regulation ofgene in porcine C2C12 myoblasts. Hubei Agric Sci, 2012, 51(8): 4147–4151 (in Chinese). 熊琪, 柴進(jìn), 張年, 等. 轉(zhuǎn)錄因子Sp1對(duì)成肌細(xì)胞中豬的表達(dá)調(diào)控作用. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 51(8): 4147–4151.

[30] Tian HP. DNA Methylation affects the SP1 transcription factor-regulated functions of FORKHEADFOX F2 in breast cancer cell [D]. Tianjin: Tianjin Medical University, 2015 (in Chinese). 田宏攀. 乳腺癌中DNA甲基化對(duì)Sp1調(diào)控FOXF2轉(zhuǎn)錄及其功能的影響[D]. 天津: 天津醫(yī)科大學(xué), 2015.

Activity and transcriptional regulatory elements of the promoter in Arctic fox () β-defensin103 gene

Min Guo1, Ziya Zhao1, Ruining Wang1, Xiaoning Zheng2, Yongdong Peng1, Zhengzhu Liu1, Xianglong Li1, and Yuanfang Gong1

1 College of Animal Science and Technology,Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, Hebei, China 2 College of Animal Science and Technology,Agricultural University of Hebei Province,Baoding 071000, Hebei, China

The aim of this study was to screen the active regions and transcription factor binding sites in the promoter of thegene related to Arctic fox coat color, and to provide a basis for revealing the molecular genetic mechanism ofgene regulating the coat color formation. The 5′-flanking region fragment 2 123 bp of Arctic foxgene was cloned, and 4 truncated promoter reporter vectors of different lengths were constructed. The promoter activity was detected by the dual-luciferase reporter assay system. Point mutations were performed on the 3 predicted specificity protein 1 (Sp1) transcription factor binding sites in the highest promoter active region, and 3 mutant vectors were constructed. The activity was then detected by the dual-luciferase reporter assay system. The results showed that the region 1 656 (?1 604/+51) had the highest activity in the 4 truncated promoters of different lengths, and the promoter activity of the three mutant vectors constructed in this region were significantly lower than that of the wild type (fragment 1 656). The region of ?1 604 /+51 was the core promoter region ofgene in Arctic fox and ?1 552/?1 564, ?1 439/?1 454 and ?329/?339 regions were positive regulatory regions. This study successfully obtained the core promoter region and positive regulation regions of the Arctic foxgene, which laid a foundation for further study on the molecular genetic mechanism of this gene regulating Arctic fox coat color.

Arctic fox,gene, promoter activity, transcriptional regulatory element

February 13, 2019;

June 19, 2019

Supported by: Natural Science Foundation of Hebei Province (Nos. C2016407114, C2017407040, C2017407037), Program for the Top Young-aged Innovative Talents of Higher Learning Institutions of Hebei Province (No. BJ2016026).

Xianglong Li. Tel: +86-335-8069521; E-mail: lixianglongcn@yahoo.com

Yuanfang Gong. E-mail: gyfkeyan@163.com

河北省自然科學(xué)基金 (Nos. C2016407114, C2017407040, C2017407037)，河北省高等學(xué)校青年拔尖人才計(jì)劃項(xiàng)目 (No. BJ2016026) 資助。

郭敏, 趙子雅, 王瑞寧, 等. 北極狐β-防御素103基因 (CBD103) 啟動(dòng)子活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(8): 1469–1477.Guo M, Zhao ZY, Wang RN, et al. Activity and transcriptional regulatory elements of the promoter in Arctic fox (Vulpes lagopus) β-defensin103 gene. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1469–1477.

(本文責(zé)編 陳宏宇)