劉歡歡，李樹東，楊雨晴，孫曉瑩，李巖，劉昕旸，陳小燕，張連妹，白永飛，侯喜林，余麗蕓

表面展示新城疫病毒部分F蛋白的重組干酪乳桿菌的構(gòu)建及其免疫原性

劉歡歡1，李樹東1，楊雨晴1，孫曉瑩1，李巖1，劉昕旸2，陳小燕2，張連妹2，白永飛2，侯喜林1，余麗蕓2

1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319

本研究旨在構(gòu)建重組干酪乳桿菌pLA-Newcastle disease virus (NDV)-F/，獲得表達(dá)產(chǎn)物，并探討其免疫效果。利用PCR擴(kuò)增攜帶部分主要抗原表位的NDV F基因，與穿梭質(zhì)粒pLA連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，篩選陽性重組質(zhì)粒，將其電轉(zhuǎn)化至干酪乳桿菌中，構(gòu)建重組干酪乳桿菌pLA-NDV-F/，應(yīng)用PCR鑒定陽性菌株，Western blotting鑒定重組菌反應(yīng)原性，間接免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦檢測蛋白表達(dá)情況。試驗選用14日齡雛雞，各組免疫方式為口服+滴鼻。設(shè)立pLA-NDV-F/兩次免疫組和三次免疫組、弱毒疫苗組、pLA/、未攻毒PBS組和攻毒PBS組。間接ELISA方法檢測雛雞血清IgG、腸道、鼻腔、肺臟中sIgA抗體效價，評價試驗組雛雞攻毒保護(hù)率。結(jié)果表明，有94.10%的重組菌表達(dá)了F蛋白，且高效表達(dá)在干酪乳桿菌細(xì)胞表面，蛋白大小為62 kDa，并能與抗NDV陽性血清特異性結(jié)合。各免疫組anti-F IgG和sIgA抗體水平顯著高于對照組，pLA-NDV-F/三次免疫組抗體持續(xù)時間比兩次免疫組延長28 d，抗體峰值沒有顯著差異。免疫pLA-NDV-F/三次、兩次、弱毒疫苗、pLA/和PBS的攻擊保護(hù)率分別為80%、80%、90%、0%和0%。因此，利用干酪乳桿菌表達(dá)體系成功表達(dá)了攜帶部分抗原表位的NDV F基因，具備良好的反應(yīng)原性和免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。

新城疫病毒，免疫原性，干酪乳桿菌，黏膜免疫，保護(hù)率

新城疫 (Newcastle disease，ND) 由新城疫病毒 (Newcastle disease virus，NDV) 引發(fā)，是危害禽類最嚴(yán)重的疫病之一，被世界動物衛(wèi)生組織認(rèn)定為必須報告的A類動物疫病。NDV在常溫下具備高度穩(wěn)定性[1]，并可通過糞口途徑和眼結(jié)膜及鼻黏膜等呼吸道黏膜侵入機(jī)體，使得該病防控困難較大[2]。

由于野生鳥類和家禽的相互傳播致使NDV變異株大量出現(xiàn)[3]，迄今為止全世界已分離出18種不同的基因型[4]，常規(guī)疫苗常無法提供足夠的保護(hù)?？乖砦皇菣C(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，截取主要抗原表位進(jìn)行基因工程疫苗研制針對性更強(qiáng)，更有利于ND的防控。NDV F蛋白存在多處抗原位點可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，在調(diào)控病毒與受體細(xì)胞膜融合、病毒侵入機(jī)體等方面具有關(guān)鍵性作用[5]。NDV F蛋白裂解位點 (Fcs) 位于NDV前體蛋白F0的第112–117氨基酸處[6]，研究表明，此處堿基的輕微改變即可影響NDV毒力和融合活性，是決定ND毒力強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素[7-8]。因此，截取涵蓋Fcs的抗原區(qū)段制備基因工程疫苗更具應(yīng)用價值。

干酪乳桿菌是腸道益生菌，可抑制胃腸道病原體生長，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的平衡，能夠誘發(fā)黏膜和全身免疫起到類似佐劑的作用[9-11]，以其作為黏膜疫苗遞送載體可以表達(dá)同源和異源蛋白[12-13]，構(gòu)建的重組菌株表達(dá)的酶無需經(jīng)過純化即可應(yīng)用于飼料添加劑等食品級用途[14]。ND主要通過黏膜途徑侵入機(jī)體，因此，以干酪乳桿菌作為抗原遞送載體研發(fā)黏膜疫苗對該病的防控具有十分重要的意義。本研究截取包括Fcs在內(nèi)的NDV F蛋白的兩處主要抗原表位基因片段，選用干酪乳桿菌表面展示表達(dá)載體pLA與目的片段連接，構(gòu)建重組干酪乳桿菌pLA-NDV-F/，通過激光共聚焦、流式細(xì)胞術(shù)檢測目的蛋白的表達(dá)情況，將表達(dá)的重組菌免疫雛雞對其免疫原性進(jìn)行分析，為制備新城疫基因工程乳酸菌疫苗的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)菌株、質(zhì)粒、試驗動物

新城疫活疫苗 (LaSota株) 購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；F48E8株由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存；大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞、干酪乳桿菌表面展示表達(dá)載體pLA、純化的重組NDV F蛋白均由本實驗室構(gòu)建保存；干酪乳桿菌購自中國工程微生物保藏中心；試驗用雞為14日齡商品蛋雞。

1.2 主要試劑和儀器

TRIzol、DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶HⅠ、Ⅰ、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T載體均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自AXYGEN公司；膠回收試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自Solarbio公司；羊抗雞IgG-HRP、FITC標(biāo)記的羊抗雞熒光二抗購自北京博奧森；山羊抗雞IgA-HRP購自Abcam公司；DAB顯色試劑盒購自中杉金橋公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞、抗NDV陽性血清由本實驗室保存，抗NDV陽性血清抗體效價經(jīng)血清中和試驗 (SNT) 測得為1︰256。凝膠成像系統(tǒng)和半干轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司；超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司；共聚焦顯微鏡，德國Leica公司。

1.3 目的基因的獲取

根據(jù)NDV F基因序列(GenBank登錄號：AF077761.1) 設(shè)計一對特異性引物，上下游引物分別插入HⅠ和Ⅰ酶切位點，上游引物序列：P1 5?-GGATCCATCATAGTTAAGCTCCTCCC-3? (下劃線部分為HⅠ)，下游引物序列：P2 5?-GTCGACGTAATCCATATTTCCACCAG-3? (下劃線部分為Ⅰ)。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物用0.9%瓊脂糖凝膠分析。

1.4 pLA-NDV-F/E. coli的構(gòu)建與鑒定

采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對1.3中PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并將其連接至pMD18-T上，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，次日挑取單菌落，進(jìn)行PCR初步鑒定、雙酶切鑒定陽性重組菌，送往深圳華大基因科技有限公司測序。將測序正確的目的片段與pLA穿梭質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中，命名為pLA-NDV-F/，經(jīng)PCR、雙酶切鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒pLA-NDV-F。

1.5 pLA-NDV-F/L. casei的構(gòu)建

將1.4獲得的陽性重組質(zhì)粒pLA-NDV-F電轉(zhuǎn)化至干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于氯霉素抗性MRS固體培養(yǎng)基中 (含氯霉素34 μg/mL)，次日挑取單菌落37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，篩選陽性重組干酪乳桿菌，并將其命名為pLA-NDV-F/。同時構(gòu)建干酪乳桿菌對照菌，命名為pLA用于動物試驗，干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備參照溫麗娟等[15]發(fā)表的方法。

1.6 pLA-NDV-F/L. casei表達(dá)目的蛋白的鑒定

1.6.1 pLA-NDV-F/.的表達(dá)

取pLA-NDV-F/和pLA/各2%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)10 h后，獲得重組蛋白。

1.6.2 Western blotting分析

獲得的重組蛋白經(jīng)溶菌酶處理后，1%上樣緩沖液重懸，SDS-PAGE后，半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳封閉、抗NDV陽性血清 (1︰50) 孵育2 h、羊抗雞IgG-HRP (1︰5 000) 孵育2 h，DAB顯色液顯色。

1.6.3 間接免疫熒光試驗

取表達(dá)10 h的pLA-NDV-F/，均勻涂布于載玻片上，放入預(yù)冷的無水乙醇中固定菌體，5%脫脂乳溶液封閉過夜，抗NDV陽性血清 (1︰50) 37 ℃孵育2 h、FITC標(biāo)記的羊抗雞熒光二抗 (1︰100) 37 ℃孵育1 h，PBS洗滌菌體后于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6.4 流式細(xì)胞術(shù)

取表達(dá)10 h的pLA-NDV-F/，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL，收集菌體用5%牛血清白蛋白4 ℃封閉過夜，依次經(jīng)抗NDV陽性血清 (1︰50)、FITC標(biāo)記的羊抗雞熒光二抗 (1︰100) 37 ℃避光孵育1 h，PBS重懸菌體，流式細(xì)胞儀檢測。

1.6.5 激光共聚焦

取流式細(xì)胞術(shù)處理后的表達(dá)菌涂布于載玻片上，封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 重組菌pLA-NDV-F/L. casei免疫攻毒保護(hù)性試驗

1.7.1 動物免疫

經(jīng)平板計數(shù)后，將菌液濃度為1011CFU/mL的pLA-NDV-F/和pLA/，通過口服和滴鼻結(jié)合的方法用于動物免疫，免疫劑量為0.2 mL/只 (口服0.15 mL，滴鼻0.05 mL)。選用14日齡雛雞，隨機(jī)分為5組，每組30只，A1和A2組免疫重組菌pLA-NDV-F/，B組免疫弱毒疫苗 (5羽份/mL)，C組免疫pLA/，D1和D2組免疫PBS。A1組為兩次免疫組，A2組為三次免疫組，D1組為攻毒PBS組，D2組為未攻毒PBS組，比較不同組別間免疫效果。具體分組情況見表2。

B組免疫按弱毒疫苗免疫程序，其余各組連續(xù)免疫菌體5 d為一次免疫，一免、二免、三免各間隔10 d，免疫開始每隔7 d每組剖殺2只雞采集血清，檢測特異性IgG抗體水平，取肺臟、腸道、鼻腔沖洗液檢測特異性sIgA抗體水平。

1.7.2 血清中IgG抗體檢測

將濃度為1 μg/mL的純化重組NDV F蛋白包被酶標(biāo)板，4 ℃包被過夜，5%脫脂乳37 ℃封閉1 h，加入待檢樣品 (1︰10) ，37 ℃孵育1 h，加入羊抗雞IgG-HRP (1︰5 000) 37 ℃孵育1 h，底 物 (TMB-H2O2) 顯色，2 mol/L H2SO4終止反 應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測，讀取450吸光值。待檢血清450/陰性血清≥2.1即為陽性結(jié)果，反之為陰性結(jié)果。

1.7.3 腸道、鼻腔、肺臟沖洗液中sIgA抗體檢測

檢測sIgA抗體，二抗選用山羊抗雞IgA-HRP (1︰10 000)，具體步驟參照1.7.2。

表1 免疫試驗

1.7.4 檢測結(jié)果顯著性分析

采用Graphpad Prism 6軟件的方差分析法對檢測結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。*：0.01<<0.05；**：0.001<<0.01；***：0.000 1<<0.001；****： 0.000 01<<0.000 1。

1.7.5 pLA-NDV-F/.攻毒保護(hù)試驗

將F48E8毒株以肌肉注射的方式，對A1組二免后7 d，A2、B、C、D1組三免后7 d的試驗雞進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為105EID50，攻毒后7 d觀察試驗雞臨床癥狀及死亡情況，計算免疫保護(hù)率。

免疫保護(hù)率(%)=(1?免疫組死亡率/對照組死亡率)×100%。D2組為未攻毒PBS組。

2 結(jié)果與分析

2.1 pLA-NDV-F/L. casei構(gòu)建與鑒定

2.1.1 PCR鑒定

以pLA-NDV-F/提取的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示有大小約為564 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致 (圖1)。

2.1.2 Western blotting鑒定

對表達(dá)10 h的pLA-NDV-F/和pLA/用溶菌酶處理后，進(jìn)行Western blotting鑒定，結(jié)果顯示，pLA-NDV-F/表達(dá)的蛋白被抗NDV陽性血清識別，在62 kDa處出現(xiàn)明顯印記 (圖2)，對照組未出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 pLA-NDV-F/L. casei PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 pLA-NDV-F/L. casei Western blotting鑒定結(jié)果

2.1.3 間接免疫熒光試驗鑒定

對pLA-NDV-F/和pLA/進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，結(jié)果表明，pLA-NDV-F/在明視野下可觀察到菌體形態(tài)(圖3A)，熒光顯微鏡下亦可觀察到明顯的綠色熒光反應(yīng)(圖3B)，且熒光為菌體發(fā)出(A，B重疊圖3C)，pLA/在明視野下可見到菌體形態(tài)(未列結(jié)果)，熒光顯微鏡下未見到綠色熒光(圖3D)，證明pLA-NDV-F/成功表達(dá)外源蛋白。

2.1.4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定

取表達(dá)10 h的pLA-NDV-F/和pLA/進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示，pLA-NDV-F/熒光強(qiáng)度明顯高于pLA/，篩選的10 000個重組乳酸菌可表達(dá)此蛋白的菌體高達(dá)94.10% (圖4)，表明pLA-NDV- F/已成功表達(dá)外源蛋白，且表達(dá)量較高。

2.1.5 激光共聚焦鑒定

利用激光共聚焦技術(shù)檢測重組菌蛋白表達(dá)情況，觀察到綠色熒光主要集中于菌體表面(圖5C)，而pLA/無此現(xiàn)象(圖5D)，與預(yù)期結(jié)果相符(圖5)。

2.2 血清IgG抗體效價測定

間接ELISA方法檢測血清中IgG抗體水平，結(jié)果顯示，pLA-NDV-F/兩次免疫組、三次免疫組和弱毒疫苗組雛雞首免后7 d即可檢測到相應(yīng)抗體，三次免疫組與兩次免疫組 (=0.098) 和弱毒疫苗組 (=0.382) 相比抗體峰值沒有顯著差異 (>0.05)，三次免疫組與兩次免疫組抗體水平于42 d后出現(xiàn)顯著性差異 (<0.05)，7 d后各試驗組抗體水平均顯著高于pLA/組和PBS組 (0.000 1<<0.001) (圖6A)。

圖3 pLA-NDV-F/L. casei熒光檢測結(jié)果

圖4 pLA-NDV-F/L. casei流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

圖5 pLA-NDV-F/L. casei激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果

圖6 重組菌免疫雛雞血清 (A) 特異性IgG抗體水平及雛雞腸道 (B)、鼻腔 (C)、肺臟 (D) 沖洗液特異性sIgA抗體水平

2.3 腸道、鼻腔、肺臟沖洗液sIgA抗體效價測定

對采集的雛雞腸道、肺臟、鼻腔沖洗液進(jìn)行間接ELISA方法檢測，腸道沖洗液檢測結(jié)果顯示，免疫pLA-NDV-F/的兩組抗體水平顯著高于對照組 (0.000 01<<0.000 1)，分別于免疫后56 d、28 d達(dá)到抗體峰值且抗體水平?jīng)]有顯著性差異 (>0.05)，三次免疫組抗體水平于42 d后顯著高于兩次免疫組。弱毒疫苗組在免疫后49 d抗體出現(xiàn)下降趨勢，各試驗組抗體水平均顯著高于pLA/組 (0.000 1<<0.001) 和PBS組 (0.000 1<<0.001) (圖6B)。

鼻腔沖洗液檢測結(jié)果表明，pLA-NDV-F/三次免疫組和兩次免疫組抗體水平分別于免疫后37 d、21 d達(dá)到抗體峰值且抗體水平?jīng)]有顯著性差異 (>0.05)，pLA-NDV-F/三次免疫組的抗體水平于35 d后顯著高于兩次免疫組 (0.01<<0.05)，于21 d后顯著高于弱毒疫苗組 (0.05<<0.01)，并顯著高于pLA/組 (0.000 1<<0.001) 和PBS組 (0.000 1<<0.001)，對照組抗體無明顯增長 (圖6C)。

肺臟沖洗液檢測結(jié)果表明，pLA-NDV-F/免疫三次組和免疫兩次組在免疫后21 d抗體出現(xiàn)明顯增長并趨于穩(wěn)定，分別于49 d和28 d達(dá)到峰值，于42 d后出現(xiàn)顯著性差異 (0.01<<0.05)，三次免疫組與弱毒疫苗組抗體水平?jīng)]有顯著性差異 (0.05)，各試驗組抗體水平極顯著高于pLA/組 (0.000 1<<0.001) 和PBS組 (0.000 01<<0.000 1) (圖6D)。

2.4 pLA-NDV-F/L. casei攻毒保護(hù)試驗結(jié)果

分別于兩次免疫和三次免疫7 d后以NDV強(qiáng)毒株F48E8對試驗雞進(jìn)行攻毒，攻毒對照組72 h內(nèi)全部死亡；未攻毒PBS組 (D2) 試驗雞全部存活，健康狀態(tài)良好。其中，免疫重組干酪乳桿菌pLA-NDV-F/的兩組于36 h開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，兩次免疫組弱毒疫苗組于48 h開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，未死亡個體健康狀態(tài)均良好，A1、A2、B、C、D1和D2各組保護(hù)率分別為80%、80%、90%、0%、0%和100% (表3)。

表2 免疫重組干酪乳桿菌保護(hù)率

3 討論

本文報道了以干酪乳桿菌作為抗原遞送載體研發(fā)一種黏膜疫苗用于雞新城疫的防控。具體為截取包括Fcs在內(nèi)的NDV F蛋白的兩處主要的抗原基因片段，與pLA穿梭質(zhì)粒相連，構(gòu)建重組干酪乳桿菌pLA-NDV-F/，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)重組菌陽性率高達(dá)94.10%，且展示在細(xì)胞表面，確定了該重組菌的應(yīng)用價值。

黏膜免疫存在歸巢效應(yīng)，誘導(dǎo)特定部位致敏的免疫細(xì)胞，約80%免疫細(xì)胞返回抗原致敏部位發(fā)揮免疫功能，表現(xiàn)為局部免疫，其余20%免疫細(xì)胞則轉(zhuǎn)移至其他黏膜部位發(fā)揮功能，致使不同黏膜部位發(fā)生相互關(guān)聯(lián)[16]。通過對鼻黏膜沖洗液中sIgA抗體的檢測可以發(fā)現(xiàn)，相對于其他組織，重組菌在此處誘導(dǎo)的抗體持續(xù)時間相對較短，與相關(guān)文章中關(guān)于乳桿菌鼻黏膜的定殖僅為3 d左右的報道基本一致[17]?？捎诜闻K沖洗液中檢測到sIgA抗體，且抗體水平和抗體持續(xù)時間均優(yōu)于鼻腔沖洗液，分析原因可能為：1) 滴鼻免疫途徑使部分重組菌抗原進(jìn)入肺臟誘發(fā)局部黏膜免疫；2) 進(jìn)入鼻腔和腸道的菌刺激產(chǎn)生的免疫細(xì)胞部分轉(zhuǎn)移至肺臟黏膜免疫組織，引起黏膜相關(guān)淋巴組織 (Mucosal associated lymphoid tissues, MALT) 免疫應(yīng)答[16]；3) 口服pLA-NDV-F/可長時間、大量存留于腸道，由此處刺激產(chǎn)生的免疫細(xì)胞可轉(zhuǎn)移刺激肺臟黏膜免疫組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答，卻不能刺激鼻相關(guān)淋巴組織 (Nasal associated lymphoid tissues, NALT) 免疫反應(yīng)[18]，可能是造成肺臟抗體持續(xù)時間長于鼻腔的原因，另外，是否因為自身免疫器官產(chǎn)生的局部免疫應(yīng)答和其他免疫細(xì)胞通過轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)的MALT免疫應(yīng)答共同作用，從而導(dǎo)致此處抗體水平較高，有待驗證。

免疫次數(shù)增多的同時免疫成本也隨之增加，因此，確定免疫次數(shù)與抗體效價、抗體持續(xù)時間的關(guān)系對于該重組菌的實際應(yīng)用具有重要意義，可以發(fā)現(xiàn)免疫兩次組和免疫三次組在誘導(dǎo)體液免疫和黏膜免疫方面產(chǎn)生的抗體峰值無顯著性差異，可能是試驗時均以相同劑量抗原用于雛雞免疫，以至于試驗雞體內(nèi)針對此劑量抗原產(chǎn)生的抗體已到達(dá)閾值，無法實現(xiàn)顯著增長。研究表明，在適當(dāng)增加抗原施用劑量時可誘發(fā)更高水平的抗體滴度[2,19]。因此，隨著免疫次數(shù)的增加，適當(dāng)增加免疫劑量或許更有利于抗體峰值的增長。攻毒試驗結(jié)果顯示A1、A2組保護(hù)率一致，表明兩次免疫和三次免疫都能抵抗病毒感染，只是三次免疫能獲得更長的免疫保護(hù)時間。免疫保護(hù)性試驗結(jié)果顯示，重組菌組免疫效果略低于弱毒疫苗組，可能因為重組菌表達(dá)的僅為部分抗原表位區(qū)，而弱毒疫苗具備天然病毒完整的抗原表位，因此能刺激機(jī)體產(chǎn)生更高的免疫應(yīng)答，但是仍需要田間免疫效果的進(jìn)一步分析。

本研究利用干酪乳桿菌表達(dá)體系成功表達(dá)了NDV F部分主要抗原表位蛋白，雛雞免疫及攻毒保護(hù)性試驗表明，重組干酪乳桿菌pLA-NDV-F/具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。

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Immunogenicity of the truncated NDV F protein surface-displayed on

Huanhuan Liu1, Shudong Li1, Yuqing Yang1, Xiaoying Sun1, Yan Li1, Xinyang Liu2, Xiaoyan Chen2, Lianmei Zhang2, Yongfei Bai2, Xilin Hou1, and Liyun Yu2

1 College of Animal Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Heilongjiang, China 2 College of Life Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Heilongjiang, China

To evaluate immune efficacy of the recombinant, we constructed pLA-Newcastle disease virus (NDV)-F/and obtained the expression products. PCR amplified the NDV F gene carrying part of the major epitopes. The target gene was inserted to the shuttle plasmid pLA, and then transformed intoBL21 (DE3) in order to screen positive recombinant plasmid. The positive recombinant plasmid was transformed intoby electroporationto construct pLA-NDV-F/The positive strains were identified by PCR. The reactivity of the recombinant bacteria was identified by Western blotting and the protein expression was detected by indirect immunofluorescence, flow cytometry and laser confocal microscopy. The 14-day-old chickens in each group were vaccinated by oral plus nose drops. The pLA-NDV-F/twice immunization group and three times immunization group, the commercial vaccine group, the pLA/group, the unchallenge PBS and the challenge PBS group were established. IgG in serum and sIgA in the lavage fluid of intestinal, nasal and lung were detected by ELISA. The protection rate of chickens was evaluated. The results showed that 94.10% of the recombinant bacteria expressed the F protein. The recombinant protein was highly expressed on the surface ofwith a protein size of 62 kDa, which specifically bound to anti-NDV serum. The levels of anti-F IgG and sIgA antibodies in each test group were significantly higher than those in the control groups. The duration of antibody in the pLA-NDV-F/three-time immunization group lasted 28 days longer than that in the twice immunized group, and there was no significant difference between antibody peak values. The attack protection rates in each group of immunized pLA-NDV-F/three times, twice, attenuated vaccine, pLA/and PBS were 80%, 80%, 90%, 0% and 0%, respectively. Therefore, the antigenic protein of NDV F was successfully expressed byexpression system, which has of reactogenicity and immunogenicity, and could induce protective immune responses in chickens.

Newcastle disease virus, immunogenicity,, mucosal immunity, protection rate

March 22, 2019;

May 20, 2019

Supported by: Heilongjiang Bayi Agricultural University Postgraduates’ Innovation Project (No. YJSCX2017-Y40), Provincial Early Stage Industrialization Cultivation Project (No. 1253CGZH14), Heilongjiang Provincial Land Reclamation Bureau Science and Technology Research Project (No. HNK135-04-06).

Liyun Yu. Tel/Fax: +86-459-6819292; E-mail: yuliyun1227@126.com

Xilin Hou. E-mail: xly_hou@163.com

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目(No. YJSCX2017-Y40)，省高校產(chǎn)業(yè)化前期培育項目(No. 1253CGZH14)，黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關(guān)項目(No. HNK135-04-06) 資助。

2019-06-18

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190617.1050.002.html

劉歡歡, 李樹東, 楊雨晴, 等. 表面展示新城疫病毒部分F蛋白的重組干酪乳桿菌的構(gòu)建及其免疫原性. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(8): 1453–1462.Liu HH, Li SD, Yang YQ, et al. Immunogenicity of the truncated NDV F protein surface-displayed on Lactobacillus casei. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1453–1462.

(本文責(zé)編 郝麗芳)