繆勝男，楊婷堯，崔文璟，周哲敏

茶堿激活型RNA分子開關的構建及在枯草芽胞桿菌中調節(jié)外源基因表達的性能

繆勝男，楊婷堯，崔文璟，周哲敏

江南大學 生物工程學院 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

枯草芽胞桿菌在工業(yè)生物技術以及合成生物學領域作為一種重要的微生物可廣泛用作代謝工程、重組蛋白表達以及新型基因電路的底盤。在中構建基于非編碼RNA的高精準調節(jié)元件，能夠實現(xiàn)不依賴蛋白質因子的基因表達調控，豐富基因表達通用工具。通過基因工程手段，設計了基于茶堿適體域的核糖開關E和適體核酶AZ調節(jié)元件，并與不同的內源組成型啟動子適配，構建出茶堿激活型基因表達控制元件。測定這兩種調節(jié)元件與6種組成型啟動子組合匹配下報告基因GFP的熒光強度，鑒定并分析各調控元件的工作性能。并進一步以紅色熒光蛋白mCherry和普魯蘭酶兩種不同的異源蛋白驗證核糖開關或適體核酶與啟動子的最優(yōu)組合。結果表明，同一種RNA調節(jié)元件與不同啟動子組合呈現(xiàn)不同水平的調控效率。在核糖開關與啟動子的組合中，啟動子PsigW和核糖開關E組合 (sigWE) 對GFP表達的誘導率最高，達到16.8。在適體核酶與啟動子的組合中，AZ與啟動子P43、PrpoB組合 (P43AZ和rpoBAZ) 的誘導率最高，分別達到了6.1和6.2。進一步驗證結果顯示，sigWE調控mCherry的誘導率最高 (9.2)，而P43E調控普魯蘭酶的誘導率最高 (32.8)，產(chǎn)酶水平達到了81 U/mL。核糖開關和適體核酶對GFP、mCherry、普魯蘭酶均能實現(xiàn)調控，但是不同元件組合的調控性能有所差異，對不同基因的調控效果也不盡相同。

核糖開關，適體核酶，枯草芽胞桿菌，基因調控

枯草芽胞桿菌作為一種重要的革蘭氏陽性模式菌，是外源基因高效表達、實現(xiàn)工業(yè)酶高效生產(chǎn)和代謝工程的理想宿主?？莶菅堪麠U菌也可作為合成微生物底盤，用于承載人工設計的基因電路，實現(xiàn)天然系統(tǒng)不能夠完成的新功能[1-3]。近年隨著遺傳工具的不斷擴展，諸如各種不同調控類型的啟動子、標準化的核糖體結合位點以及部分ρ因子非依賴型終止子的構建、開發(fā)和鑒定[4]，這一宿主已經(jīng)被廣泛認為是一種能與大腸桿菌相媲美的合成生物學底盤。

細菌通過基因調控來應對自身代謝和周圍環(huán)境的變化，因此基因調控對于合理應用體內物質和能量具有重要意義[5]，同時基因表達調控在蛋白質表達、代謝工程、合成生物學領域也多有應用。已有的基因表達工具多依賴誘導型啟動子實現(xiàn)調控，這種系統(tǒng)需要一個或多個輔助蛋白來激活目標基因表達[6]。其中最經(jīng)典的就是受IPTG誘導的啟動子，IPTG通過與轉錄阻遏蛋白LacI結合，使LacI從操縱位點上脫離下來從而誘導下游基因，但是IPTG誘導對菌體造成生長壓力，會阻礙細菌的生長；另一種常用的受木糖誘導的啟動子，通過與XylR阻遏蛋白相互作用進行調控，但是木糖誘導調控會參與代謝途徑，產(chǎn)生相互干擾。RNA元件因為系統(tǒng)元件小，構成簡單，無需蛋白參與逐漸成為研究熱點，通過在mRNA上融合適體域，使其對相應配體的存在作出響應，從而調控基因表達[7]。

用于調控原核生物基因表達的非編碼RNA元件有多種，其中應用最廣泛的有兩類：核糖開關(Riboswitch) 和適體核酶(Aptazyme)[8-11]。核糖開關由一個可以響應高親和力配體的適體域(Aptamer) 和表達平臺域組成；通過利用適體域區(qū)域固有的三級結構來識別特異性的配體并結合配體[12]，能夠感知配體的濃度。核糖開關在轉錄水平和翻譯水平均可實現(xiàn)調控[13]，轉錄水平的調控是通過在表達平臺域形成終止子或者抗終止子影響RNA聚合酶的功能，從而引起轉錄的終止或激活[14-15]；翻譯水平的調控通過配體和適體域的結合改變莖環(huán)結構，從而暴露或者隱藏SD序列，激活或終止翻譯的進行。核糖開關現(xiàn)已在大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等其他菌株中作為調控元件調控外源基因的表達。Mandal等[16]發(fā)現(xiàn)并驗證了受甘氨酸調控的天然核糖開關，通過配體結合兩個適體域后的協(xié)同作用來確保多余的甘氨酸能一方面作為檸檬酸循環(huán)的碳源，另一方面用來維持足夠的氨基酸保證蛋白質的合成。Amy等[17]在藍藻中通過篩選和合理設計開發(fā)了茶堿核糖開關，實現(xiàn)了翻譯水平上的調控；Cui等[18]進一步證明茶堿誘導型核糖開關能在枯草芽胞桿菌中被成功激活，同時核糖開關具有配體依賴性。

適體核酶是人工設計出來的由天然或改造后的核酶(Ribozyme) 以及不同適體域組合而成的新型元件。其中，錘頭狀核酶是小型的自分裂RNA，首次在類病毒和植物病毒的RNA中發(fā)現(xiàn)[19]，可催化特定磷酸二酯鍵在轉環(huán)復制過程中的異構化反應。適體核酶具有作用方式多樣、調控嚴謹、結構高度模塊化等特點[20]，既能和配體高特異性結合，又有核酶的催化活性。在無配體存在時，不具有或者具有較低的活性，而在配體存在時，配體會與適體核酶上的適體域結合從而誘發(fā)核酶的自我裂解作用，由無活性轉變?yōu)橛谢钚誀顟B(tài)，從而發(fā)揮對下游基因的調控作用。Wieland等[21]通過在錘頭狀核酶的莖環(huán)Ⅲ上融合茶堿適體域，在大腸桿菌中實現(xiàn)對GFP表達的調控。RNA元件的發(fā)現(xiàn)和研究進一步拓展了人們對基因表達調控的認知，而且RNA元件作為一種基因功能研究的工具，對于特異表達啟動子的研究和應用具有重要意義。

上游啟動子對于核糖開關和適體核酶調控蛋白的性能會產(chǎn)生很大影響。因此本研究通過在枯草芽胞桿菌中將核糖開關和適體核酶與不同的組成型啟動子進行匹配，分析啟動子兼容性對調節(jié)元件的影響，對RNA元件的性質進行分析；同時分析了適體核酶和核糖開關調控不同蛋白的適用性，為進一步研究和應用提供實驗依據(jù)。研究結果發(fā)現(xiàn)茶堿核糖開關和茶堿適體核酶能夠與多種來源的內源啟動子匹配，但不同啟動子與核糖開關和適體核酶匹配后呈現(xiàn)的調控性能有差異；茶堿核糖開關和茶堿適體核酶對GFP、mCherry、普魯蘭酶均能實現(xiàn)調控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

實驗所用質粒詳見表1。

1.1.2 主要試劑和儀器

PrimeSTAR?Max DNA 聚合酶購自TaKaRa公司；2*GenRec重組試劑盒購自通用生物系統(tǒng)(安徽) 有限公司；質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京) 有限公司；膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；DMSO、茶堿購自生工生物工程(上海) 股份有限公司。PCR儀、蛋白電泳儀購自BIO-RAD公司；分光光度計購自上海美譜達儀器有限公司；多功能酶標儀購自BioTeck公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建

質粒pBSG03A (由P43啟動子控制GFP表達的大腸桿菌-枯草芽胞桿菌穿梭表達載體) 由本實驗室保存。以該質粒為模板采用定點突變和Infusion重組的方式構建突變體，所構建的質粒如表1所示，表2為構建相應質粒時的引物。在PCR得到的基因產(chǎn)物中加入Ⅰ酶反應2 h以消除模板，對PCR產(chǎn)物進行純化后對其進行基因組裝，然后轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞進行轉化并提取質粒測序，待序列驗證正確后，再將其轉入枯草芽胞桿菌，進行驗證。

表1 本研究所用質粒

1.2.2 茶堿核糖開關的構建

基于茶堿調控的核糖開關(圖1) 在未加入茶堿時，SD被隱藏在莖環(huán)內，核糖體無法結合SD，基因無法進行表達；加入茶堿配體后，核糖開關構象發(fā)生改變，SD被暴露出來，翻譯開始進行。根據(jù)啟動子序列設計引物(表2)，以質粒pBSG11/pP43EGFP[18]為模板進行PCR，獲得含有不同啟動子與茶堿核糖開關E組合匹配的重組表達質粒，將重組表達質粒轉入168中，獲得含有茶堿核糖開關與不同啟動子組合匹配的基因工程菌。

表2 本研究所用引物序列

圖1 茶堿核糖開關調節(jié)基因表達原理示意圖

1.2.3 茶堿適體核酶的構建

基于茶堿調控的適體核酶(圖2) 在未加入配體時，SD被隱藏在莖環(huán)內，核糖體無法結合SD，基因無法進行表達；加入茶堿配體后，構象發(fā)生改變，核酶發(fā)生自我剪切，SD暴露出來，翻譯開始進行。根據(jù)Aptamer Database所提供的茶堿適體域序列和來源于曼氏血吸蟲的錘頭狀核酶序列設計適體核酶序列并化學合成，獲得含適體核酶序列的質粒pUCSmTheo-AZ。然后利用引物sm-aptazyme-F/sm-aptazyme-R (表2)，以pUCSmTheo- AZ為模板進行PCR，獲得含有適體核酶序列的片段PAZSDE1，回收并純化，再以該片段作為大引物，pBSG03A質粒為模板進行PCR，得到重組表達質粒pP43AZGFP-A；以重組表達質粒pP43AZGFP-A為模板，用引物SDE1 CM 6N對通信模塊(Communication module，CM)部分進行PCR建庫篩選(方法1.2.4) 獲得具有調控功能的質粒pP43AZGFP/pP43AZGFP-CM3nt-BG8。再將重組表達質粒轉入.168中，即得基因工程菌PBP43AZGFP。再根據(jù)啟動子序列設計引物(表2)，以質粒pP43AZGFP為模板，進行PCR，獲得含有不同啟動子與茶堿適體核酶AZ組合匹配的重組表達質粒，將重組表達質粒轉入168中，獲得含有茶堿適體核酶與不同啟動子組合匹配的基因工程菌。

圖2 茶堿適體核酶調控基因表達原理示意圖

1.2.4 茶堿適體核酶通信模塊文庫的構建和篩選

茶堿適體核酶的適體域和核酶結構依靠兩者之間的通信模塊連接[22]。適體域結合茶堿后，將RNA二級結構的變化通過CM傳遞給核酶，從而使核酶從無活性的狀態(tài)轉變?yōu)榛罨淖粤呀鉅顟B(tài)，釋放被封閉的SD序列，從而啟動蛋白質的翻譯。本研究中為了獲得高效的CM，設計了3–5 nt的隨機序列作為CM，構建CM文庫。以重組表達質粒pP43AZGFP-A為模板，用引物SDE1 CM 6N (表2) 進行PCR。PCR產(chǎn)物用Ⅰ消化2 h，轉入JM109，收集平板上所有菌落，提取總質粒，轉入168。37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取不同單菌落于96深孔板中培養(yǎng)12 h，取樣，檢測600和GFP表達；然后在96深孔板中添加終濃度4 mmol/L的茶堿，再培養(yǎng)12 h，取樣，檢測600和GFP表達。

1.2.5 綠色熒光蛋白GFP和紅色熒光蛋白mCherry報告基因表達水平的測定

將測序正確的枯草芽胞桿菌在平板劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種到含有卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，再以1%的接種量將種子液分別接至含有2% DMSO、2% DMSO和終濃度4 mmol/L茶堿的50 mL LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，24 h后取發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 8.0) 洗滌3次，再用PBS將其懸浮并稀釋一定濃度，取200 μL至96孔板，檢測600和GFP熒光強度。GFP熒光強度在激發(fā)光495 nm、發(fā)射光525 nm處進行檢測。mCherry的熒光強度在激發(fā)光587 nm、發(fā)射光610 nm處進行檢測。熒光強度以a.u.表示。

1.2.6 普魯蘭酶的表達及酶活的測定

將測序正確的枯草芽胞桿菌進行平板劃線，挑取單菌落PBP43EPUL、PBsigWEPUL、PBP43AZPUL、PBrpoBAZPUL于含有卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，再以1%的接種量將種子液分別接至含有2% DMSO、2% DMSO和終濃度4 mmol/L茶堿的50 mL的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，24 h后取樣檢測600和基因表達。樣品于12 000 r/min離心5 min分別收集 菌體和上清，將菌體PBS緩沖液洗滌3次，再用含溶菌酶的TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA，pH 8.0) 將其懸浮，在37 ℃下反應30 min，并進行超聲破碎，離心取上清，獲得酶液。

取50 μL 底物、40 μL緩沖液和10 μL適當稀釋酶液混合，65 ℃下反應15 min，加入200 μL 3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)，煮沸5 min顯色，待冷卻后用蒸餾水補足體積至500 μL，測定550，每個反應做3個平行，每組測定做適當空白。將每分鐘產(chǎn)生與1 μmol葡萄糖相同的還原力所需酶量定義為1 U。

1.2.7 SDS-PAGE

將所取的培養(yǎng)液12 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS緩沖液洗滌3次，再用含有1 mg/mL溶菌酶的TE 緩沖液懸浮，37 ℃溫育30 min，超聲破碎適當時間，12 000 r/min離心5 min；取100 μL離心上清，加入25 μL 5×上樣緩沖液，沸水浴10 min。使用5%的濃縮膠和12%的分離膠進行蛋白分離，考馬斯亮藍R250染色顯示條帶。

In-gel fluorescence[23]：樣品12 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS緩沖液洗滌3次，再用含有1 mg/mL溶菌酶的TE緩沖液懸浮，37 ℃溫育30 min，超聲破碎適當時間，12 000 r/min離心 5 min；取100 μL離心上清，加入25 μL 5×上樣緩沖液。使用不含SDS的蛋白膠進行分離，在紫外光下成像，可特異性地顯示目的蛋白，過濾掉其他不發(fā)光的背景蛋白。

2 結果與分析

2.1 不同組成型啟動子匹配茶堿核糖開關后調控報告基因GFP表達的性能

為了深入探討茶堿核糖開關在中對不同內源啟動子的兼容程度，本研究從DBTBS庫中選擇了6種序列明確的內源啟動子PrpoB[24]、Pylbp[25]、PspoVG[26]、PminC[27]、PsigW[28]、PyqeZ[28]與茶堿核糖開關E融合，轉化后構建出重組菌PBrpoBEGFP、PBylbpEGFP、PBspoVGEGFP、PBminCEGFP、PBsigWEGFP、PByqeZEGFP。經(jīng)過4 mmol/L的茶堿處理24 h后，檢測標準化的GFP熒光強度(F.I/600)，通過與只經(jīng)過溶劑DMSO處理的對照組對比，檢測誘導率(誘導后基因表達/未誘導基因表達)，作為茶堿核糖開關功能的主要評價參數(shù)。結果如圖3所示，茶堿核糖開關與6種組成型啟動子融合均能夠改變組成型表達特點，與僅用DMSO處理的對照組相比，經(jīng)過4 mmol/L的茶堿處理后GFP的表達強度均有所提高，6株重組菌呈現(xiàn)出不同水平的誘導率。其中核糖開關E與啟動子PrpoB匹配構成的調控元件rpoBE介導的GFP表達水平最高，處理24 h后達到(2 047 620±9 570) a.u.，與核糖開關E和啟動子P43構成的調控元件P43E[18]相比，基因表達水平相當，但誘導率略低；而sigWE介導的表達調控呈現(xiàn)的誘導率最高，達到16.8。

隨后，為了確證GFP熒光強度檢測結果，利用SDS-PAGE和In-gel fluorescence法檢測茶堿處理前后GFP的蛋白表達水平，結果如圖4所示，經(jīng)過4 mmol/L茶堿處理24 h后，GFP相對于未處理的對照組表達水平均明顯提升，并且P43E和rpoBE介導的GFP表達水平顯著高于其他含有相同核糖開關所介導的GFP表達水平，與圖3得到的結果一致。這一結果充分表明茶堿核糖開關E能夠與多種來源的內源啟動子匹配，匹配后可實現(xiàn)基因的誘導調控，但不同啟動子與核糖開關E匹配后呈現(xiàn)的調控性能有差異。

3.1.3患者因素 在X線攝片過程中，由于患者有外傷，疼痛較重，不能正確配合技術人員擺位，只能攝取一些被動體位?；蛘呤且恍┗颊呱砩嫌胁荒苋∠碌慕饘佼愇锘虿荒苋コ蓛舻母嗨帲瑢е聜斡暗陌l(fā)生。還有一些患者不能控制自己的運動，產(chǎn)生運動偽影。特別是一些腦外傷合并胸部外傷的患者，他們攝片時往往處于一種淺而短的呼吸狀態(tài)，這樣胸廓運動造成偽影使X線片模糊不清[2]。這些都會使圖像質量下降，從而使診斷的正確性降低。

2.2 適體核酶與不同內源組成型啟動子的適配及調控功能鑒定

為了構建受適體核酶調控的基因表達元件，需設計茶堿適體域與核酶的融合元件。在此，需要設計并篩選適宜于連接茶堿適體域和錘頭狀核酶的通信模塊(CM)。通過構建由3–5 nt隨機序列構成的CM文庫，系統(tǒng)篩選與此兩個部分兼容性強的模塊。以質粒pP43AZGFP-A為模板，用含隨機序列的引物SDE1 CM 6N構建文庫。高通量篩選結果顯示，獲取了含有不同調控功能的適體核酶(圖5A)，其中選擇含有元件BG8 (5′-GGT···32 nt···TCT-3′)的菌株PBP43AZGFP作為后續(xù)的研究菌株。將元件BG8在后續(xù)的研究中命名為適體核酶AZ。同時引入Zhong等[29]使用的WHBS (加權氫鍵得分) 參數(shù)進行分析。在此，利用這一參數(shù)探討枯草芽胞桿菌中通信模塊的結構特征與本底表達水平之間的相關性。結果如圖5B所示，WHBS與本底表達在0.05水平上顯著相關，因此可通過WHBS預測含有適體核酶菌株的本底表達來進行理性設計。

圖3 啟動子-核糖開關組合調節(jié)GFP表達

圖4 SDS-PAGE和In-gel fluorescence檢測啟動子-核糖開關組合調控GFP表達

圖5 通信模塊對適體核酶功能的影響

為了進一步探討茶堿適體核酶在中對不同內源啟動子的兼容性，本研究選擇與上述相同的6種s內源啟動子PrpoB、Pylbp、PspoVG、PminC、PsigW、PyqeZ與適體核酶AZ融合，轉化后構建出重組菌PBrpoBAZGFP、PBylbpAZGFP、PBspoVGAZGFP、PBminCAZGFP、PBsigWAZGFP、PByqeZAZGFP。經(jīng)過4 mmol/L的茶堿處理24 h后，檢測GFP熒光強度(F.I/600)，通過與只經(jīng)過溶劑DMSO處理的對照組相比(本底滲漏表達水平)，計算誘導率，作為茶堿適體核酶功能的主要評價參數(shù)。結果如圖6所示，與適體核酶適配后，6種組成型啟動子均呈現(xiàn)受茶堿激活的調控特征，與僅用DMSO處理的對照組相比，經(jīng)過4 mmol/L的茶堿處理后GFP的表達強度均有不同程度提高，并呈現(xiàn)出不同水平的誘導率。其中適體核酶AZ與啟動子PrpoB匹配構成的調控元件rpoBAZ介導的GFP表達水平最高，處理24 h后為 (172 773±2 625) a.u.，且rpoBAZ介導的表達調控呈現(xiàn)的誘導率也最高，達到6.2。適體核酶AZ與啟動子Pylbp匹配構成的調控元 件ylbpAZ介導的GFP的本底表達水平最低，為 (4 637±1 119) a.u.。

隨后，為了確證GFP熒光強度檢測結果，利用SDS-PAGE和In-gel fluorescence法檢測經(jīng)茶堿處理后GFP的表達水平，結果如圖7所示，與未處理的對照組相比，經(jīng)過4 mmol/L茶堿處理24 h后GFP的表達水平均顯著提高，且P43AZ和rpoBAZ介導的GFP表達水平顯著高于其他啟動子-適體核酶元件所介導的GFP表達水平，與圖6得到的結果一致。這一結果表明茶堿適體核酶AZ能夠與多種來源的內源啟動子匹配，匹配后可實現(xiàn)基因的誘導調控，但不同啟動子與適體核酶AZ匹配后呈現(xiàn)的調控性能有差異。

圖6 啟動子-適體核酶組合調控GFP表達

圖7 SDS-PAGE和In-gel fluorescence檢測啟動子-適體核酶組合調控GFP表達

2.3 核糖開關和適體核酶調控mCherry的表達性能

為了研究核糖開關和適體核酶對不同基因的兼容性，分別選取上述研究中表達調控元件P43E、sigWE、P43AZ、 rpoBAZ用來進一步分析這些元件的適用性和兼容性，評價核糖開關以及人工適體核酶基因表達元件工作性能。首先，使用mCherry作為檢驗蛋白，與上述元件進行融合，構建菌株PBP43EmCherry、PBsigWEmCherry、PBP43AZmCherry、PBrpoBAZmCherry。結果如圖8A所示，P43E介導的mCherry的熒光強度最高，達到 (128 607±984) a.u.，而sigWE元件介導的mCherry表達的誘導率最高，達到9.2。且核糖開關和適體核酶對mCherry的調控在蛋白表達水平和誘導率水平上與GFP相比趨勢相似。SDS-PAGE和In-gel fluorescence (圖8B、8C) 結果顯示，與只經(jīng)過DMSO處理的對照組相比，加入4 mmol/L茶堿后，均能啟動mCherry的表達。這一結果表明茶堿激活型核糖開關與適體核酶能夠與多種來源的內源啟動子匹配組合，實現(xiàn)基因的誘導調控，并且不同啟動子和元件匹配后呈現(xiàn)的調控效果不同。核糖開關調控的外源基因激活后表達水平較適體核酶更高，而適體核酶調控的基因表達嚴謹性較核糖開關更強。

2.4 茶堿核糖開關和適體核酶調控元件對普魯蘭酶的調控性能

為了擴展茶堿調節(jié)的RNA元件應用范圍，檢驗元件的可靠性。將普魯蘭酶融合到P43E、sigWE和P43AZ、rpoBAZ的下游，構建出菌株PBP43EPUL、PBsigWEPUL、PBP43AZPUL、PBrpoBAZPUL。通過測定細胞破碎上清中的酶量和酶活性變化，檢測這4種元件調控普魯蘭酶的性能。結果如圖9所示，核糖開關E與P43啟動子匹配構成的調控元件P43E介導的普魯蘭酶的表達量最高，產(chǎn)酶水平也最高，為 (80.99±2.84) U/mL，誘導率也最高，達到32.8。SDS-PAGE結果顯示，在97.2 kDa下方有一條表達條帶(圖9A) 為普魯蘭酶目的條帶，其中表達量最高的是誘導后的PBP43EPUL，進一步分析發(fā)現(xiàn)，盡管不同組合的RNA元件調控的性能有差異，但是核糖開關和適體核酶對于酶的表達均能實現(xiàn)調控，啟動子P43介導的RNA元件結果進一步表明，融合同一組成型啟動子的條件下，核糖開關誘導后的激活水平較適體核酶更高，適體核酶調控的嚴謹性較核糖開關更好。

圖9 啟動子-核糖開關組合和啟動子-適體核酶組合調控PUL的表達

3 結論

本文成功構建了核糖開關和適體核酶調控表達的枯草芽胞桿菌，并對它們的性質進行了分析。核糖開關和適體核酶對于不同的啟動子均具有調控功能，且從本底基因表達、誘導后基因表達、誘導率的水平綜合評價，核糖開關的調控范圍大，誘導后GFP熒光強度可高至(2 047 620±9 570) a.u.，誘導率最高可至16.8，而適體核酶調控的嚴謹性好，本底熒光強度可低至(4 637±1 119) a.u.。

核糖開關和適體核酶均能夠在匹配組成型啟動子后被茶堿激活，啟動多種外源基因的表達。兩者介導的基因表達調控性能有所差異。在同一組成型啟動子條件下，匹配核糖開關的調控元件激活后能夠輸出較高的蛋白表達水平，而自身同樣具有較高滲漏表達的特點；匹配適體核酶的元件受茶堿激活前后呈現(xiàn)較低的本底表達，同時外源基因表達水平也相對較低。核糖開關高表達、高誘導率的特點可以有效地驅動枯草芽胞桿菌中的基因調控，而適體核酶低滲漏表達的特點對于設計枯草芽胞桿菌中更復雜的遺傳線路具有重要意義。

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Construction and application of theophylline-activated RNA switches in the regulation of expression of recombinant proteins in

Shengnan Miao, Tingyao Yang, Wenjing Cui, and Zhemin Zhou

Key Laboratory of Industrial Biotechnology (MOE), School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

can be widely used as an important microorganism for metabolic engineering and recombinant proteins expression in industrial biotechnology and synthetic biology. However, it is difficult to make accurate regulation of exogenous gene by biological tools in, which limits the application ofin synthetic biology. The purpose of this study is to develop regulatory tools for precise control of gene expression by using non-coding RNAs, by which the activation of heterologous gene could be achieved without the auxiliary protein factors. We constructed the synthetic riboswitch E and aptazyme AZ using the theophylline aptamer. Six different native promoters fromwere functionally adapted with the E and AZ to fabricate an array of novel regulatory elements activated by theophylline. Then, we determined the performance of these elements using green fluorescence protein as reporter, and then further verified using red fluorescence protein and pullulanase as cargo proteins.Results showed that the same kind of RNA elements with different promoters showed different levels of efficiency. Promoter PsigWand E combination (sigWE) had the highest induction rate in. Compared with the control group, it can produce the induction rate of 16.8. Promoter PrpoBand AZ combination (rpoBAZ) showed the highest induction rate of 6.2. SigWE mediated mCherry induction rate was 9.2, and P43E mediated pullulanase induction rate was 32.8, in which enzyme activity reached 81 U/mL. This study confirmed that GFP, mCherry and pullulan can all be regulated by riboswitch and aptazyme, but there were differences between different combinations of promoters with RNA regulators.

riboswitch, aptazyme,, gene regulation

January 21, 2019;

March 19, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21878125).

Zhemin Zhou. Tel: +86-510-85325210; Fax: +86-510-85197551; E-mail: zhmzhou@jiangnan.edu.cn

國家自然科學基金(No. 21878125) 資助。

繆勝男, 楊婷堯, 崔文璟, 等. 茶堿激活型RNA分子開關的構建及在枯草芽胞桿菌中調節(jié)外源基因表達的性能. 生物工程學報, 2019, 35(8): 1478–1490.Miao SN, Yang TY, Cui WJ, et al. Construction and application of theophylline-activated RNA switches in the regulation of expression of recombinant proteins in Bacillus subtilis. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1478–1490.

(本文責編 陳宏宇)