王 萍，王功霞，曹 沖*

（1.山東醫(yī)藥技師學院，山東 泰安 271016；2.山東省藥學科學院 山東省化學藥物重點實驗室，山東 濟南250101）

被動皮膚過敏試驗是《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導原則》[1]規(guī)定的檢測注射劑藥物過敏性的試驗方法之一，通常選用大鼠為試驗動物，陽性對照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì)，致敏給藥方法可選擇靜脈、腹腔或皮下注射液等，共給藥3～5次，末次致敏后第10～14天制備致敏血清。

研究發(fā)現(xiàn)[2-5]，以卵白蛋白為致敏原進行大鼠被動皮膚過敏試驗時，加入佐劑條件下動物對抗原更為敏感，免疫效果較好，常用的佐劑為氫氧化鋁凝膠佐劑，但配制方法較繁瑣，對pH值要求較高。大鼠抗體產(chǎn)生階段，致敏給藥方法多選用皮下注射，由于佐劑的吸收速度慢，導致皮下注射后易形成腫塊，且有些受試物臨床給藥途徑明確指出禁止皮下給藥。針對以上問題，本試驗以卵白蛋白為致敏原，佐劑選擇Sigma公司生產(chǎn)的油佐劑──弗氏完全佐劑，致敏給藥方法選擇腹腔注射，研究不同給藥劑量，不同致敏次數(shù)，末次致敏后不同制備血清時間等因素條件對大鼠被動皮膚過敏試驗免疫應答結(jié)果的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACS-JJ-Tiger電子計價秤（梅特勒-托利多）；ME204E電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 試劑

卵白蛋白（批號：326A052，Sigma公司）；0.9 %氯化鈉注射液（批號：1C16101307，山東齊都藥業(yè)）；弗氏完全佐劑（批號SLBM2183V，Sigma公司）。

1.3 動物

SD大鼠，SPF級，體重100～200 g，雌雄各48只，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物實驗設施。試驗在屏障環(huán)境動物實驗設施進行，實驗動物使用許可證號SYXK（魯）20140008，動物房溫度20～26 ℃，濕度40 %～70 %。

2 方法

2.1 分組、致敏與致敏血清制備

96只大鼠隨機分為16組，每組6只，2只用于抗血清制備，4只用于被動激發(fā)。將卵白蛋白溶液與弗氏完全佐劑按1:1比例混勻，1，2，5，6，9，10組大鼠于第1，3，5天分別腹腔注射給予致敏物與佐劑混合物1 ml，各組均致敏3次；3，4，7，8，11，12組大鼠于第1，3，5，7，9天分別腹腔注射給予相同混合物1 ml，各組均致敏5次。陰性對照組大鼠給予0.9 %氯化鈉注射液與弗氏完全佐劑的混合物，13、14組致敏3次，15，16組致敏5次。末次致敏后第10天或第14天，大鼠以1 %戊巴比妥鈉麻醉（50 mg/kg，腹腔注射）后腹主動脈采血，血液樣本在室溫下1500 r/min離心10 min。取上清，將每組動物的抗血清混合。

表1 試驗設計

2.2 被動致敏及激發(fā)

各組制備好的抗血清用0.9 %氯化鈉注射液稀釋成不同濃度，分別為原液、1:2，1:4，1:8。采用10 mg/ml丙泊酚，按10 mg/kg尾靜脈注射麻醉大鼠，在距離脊柱約1.5 cm處背部脫毛，脫毛區(qū)域約5 cm×6 cm。在脫毛區(qū)域旁，按一定方向皮內(nèi)注射各對應組的不同稀釋度抗血清0.1 ml。24 h后分別靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量0.5 %伊文思藍染料共1 ml[6]。

2.3 藍斑測定

激發(fā)后約30 min用3 %戊巴比妥鈉麻醉（90 mg/kg，腹腔注射）處死動物，測量背部皮膚藍斑直徑，以長徑與短徑的平均值作為藍斑直徑。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第10天制備致敏血清）

13組：采用0.9 %氯化鈉注射液3次致敏，末次致敏后第10天制備血清，4只動物均未出現(xiàn)藍斑。

1，5，9組：卵白蛋白劑量為5 mg/只時，4只動物在原液、1:2注射點出現(xiàn)藍斑，藍斑直徑均大于5 mm，陽性反應率為100 %；4只動物在1:4注射點出現(xiàn)藍斑，3只動物藍斑直徑大于5 mm，陽性反應率為75 %；2只動物在1:8注射點出現(xiàn)藍斑，1只動物藍斑直徑大于5 mm，陽性反應率為25 %。卵白蛋白劑量為10，20 mg/只時，各組均有4只動物在原液、1:2、1:4、1:8注射點均出現(xiàn)藍斑，且藍斑直徑均大于5 mm，陽性反應率為100 %。見表2。

表2 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第10天制備致敏血清，）

表2 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第10天制備致敏血清，）

注：n代表陽性反應動物數(shù)，N代表動物總數(shù)

卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:8）n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm 1 5 4/4 14.19±3.08 4/4 8.68±1.99 3/4 6.90±2.78 1/4 2.86±3.29 5 10 4/4 17.18±1.97 4/4 10.00±1.77 4/4 8.35±2.10 4/4 6.44±1.10 9 20 4/4 19.17±2.09 4/4 13.69±2.32 4/4 10.21±1.71 4/4 6.50±1.03 13 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:2）卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:4）

3.2 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第14天制備致敏血清）

14組：采用0.9 %氯化鈉注射液3次致敏，末次致敏后第14天制備血清，4只動物均未出現(xiàn)藍斑。

2，6，10組：卵白蛋白劑量為5 mg/只時，4只動物在原液、1:2注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為100 %；2只動物在1:4注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為50 %；1只動物在1:8注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為25 %。卵白蛋白劑量為10，20 mg/只時，各組均有4只動物在原液、1:2注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為100 %；3只動物在1:4注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為75 %；2只動物在1:8注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為50 %。見表3。

表3 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第14天制備致敏血清，）

表3 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第14天制備致敏血清，）

注：n代表陽性反應動物數(shù)，N代表動物總數(shù)

卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:8）n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm 2 5 4/4 12.93±2.92 4/4 9.82±1.53 2/4 3.72±4.00 1/4 1.29±2.39 6 10 4/4 14.23±3.70 4/4 10.87±1.20 3/4 6.78±4.50 2/4 3.60±4.03 10 20 4/4 16.06±3.33 4/4 11.06±1.24 3/4 6.54±4.23 2/4 3.71±4.07 14 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:2）卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:4）

3.3 5次致敏后被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第10天大鼠制備致敏血清）

15組：采用0.9 %氯化鈉注射液5次致敏，末次致敏后第10天制備血清，4只動物均未出現(xiàn)藍斑。

3，7，11組：卵白蛋白劑量為5 mg/只時，4只動物在原液、1:2注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為100 %；3只動物在1:4注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為75 %；1只動物在1:8注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為25 %。卵白蛋白劑量為10 mg/只時，4只動物在原液、1:2注射點均出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為100 %；3只動物在1:4注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為75 %；1只動物在1:8注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為25 %。卵白蛋白劑量為20 mg/只時，4只動物在原液、1:2、1:4注射點均出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為100 %；2只動物在1:8注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為50 %。見表4。

表4 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第10天制備致敏血清，）

表4 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第10天制備致敏血清，）

注：n代表陽性反應動物數(shù)，N代表動物總數(shù)

卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:8）n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm 3 5 4/4 13.37±2.38 4/4 10.17±2.80 3/4 5.64±4.16 1/4 1.99±3.69 7 10 4/4 16.10±2.88 4/4 12.82±1.99 3/4 6.07±4.17 1/4 1.81±3.40 11 20 4/4 17.13±2.65 4/4 12.08±1.88 4/4 10.90±1.90 2/4 3.98±4.31 15 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:2）卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:4）

3.4 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第14天制備致敏血清）

16組：采用0.9 %氯化鈉注射液，5次致敏，末次致敏后第14天制備血清，4只動物均未出現(xiàn)藍斑。

4，8，12組：卵白蛋白劑量為5，10，20 mg/只時，各組均有4只動物在原液、1:2注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為100 %；3只動物在1:4注射點出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為75 %；各組4只動物在1:8注射點均未出現(xiàn)藍斑。見表5。

表5 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第14天制備致敏血清，）

表5 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（第14天制備致敏血清，）

注：n代表陽性反應動物數(shù)，N代表動物總數(shù)

卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:8）n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm n/N 藍斑直徑/mm 4 5 4/4 13.25±2.06 4/4 9.74±1.35 3/4 5.92±3.82 0/4 0 8 10 4/4 15.40±2.40 4/4 11.41±1.83 3/4 6.67±4.20 0/4 0 12 20 4/4 17.09±1.71 4/4 13.11±1.60 3/4 8.18±5.12 0/4 0 16 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:2）卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:4）

4 討論

被動皮膚過敏試驗中影響免疫應答的因素很多，如動物種屬、致敏劑量、致敏次數(shù)、致敏途徑、抗血清制備時間、是否添加佐劑等。大鼠已被廣泛用于過敏性評價試驗[9]，SD大鼠是常用的非臨床研究用實驗動物，有大量的生物學歷史數(shù)據(jù)，動物免疫原性較強，因此本研究選用SD大鼠進行試驗。王金華等[10]研究表明，以卵白蛋白為致敏原進行大鼠被動皮膚試驗，在不加佐劑的條件下，激發(fā)后無藍斑出現(xiàn)，結(jié)果為陰性，但在加弗氏完全佐劑的條件下，結(jié)果為陽性。不同佐劑對實驗結(jié)果影響也不同，戴學棟等[11]使用3種佐劑比較了SD大鼠被動皮膚過敏的反應程度，陽性反應率和藍斑直徑從大到小依次為氫氧化鋁＞百白破聯(lián)合疫苗＞弗氏完全佐劑，加入佐劑時，均能提高SD大鼠的敏感性，其中以氫氧化鋁效果最好。氫氧化鋁凝膠無市售成品，需自行配制[12]，方法繁瑣，而弗氏佐劑為油性佐劑[13]，無需配制，質(zhì)量穩(wěn)定，因此本試驗致敏過程也選用弗氏完全佐劑，1:1與卵白蛋白混合后致敏。指導原則中，致敏給藥方法可選擇靜脈、腹腔或皮下注射等，共給藥3～5次，末次致敏后第10～14天制備致敏血清，大鼠抗體產(chǎn)生階段，致敏給藥方法多選用皮下注射[14-15]，有些藥物說明書中明確說明禁止皮下給藥，因此本試驗研究了腹腔注射致敏途徑下，不同致敏劑量（5，10，20 mg/只）、致敏次數(shù)（3次、5次）、不同抗血清制備時間（末次致敏后第10天、第14天）等因素對大鼠被動皮膚過敏試驗的影響。

結(jié)果表明，以卵白蛋白+弗氏完全佐劑作為抗原，卵白蛋白在5～20 mg/只劑量下，各組藍斑直徑與血清稀釋倍數(shù)呈遞減關(guān)系，藍斑直徑隨血清稀釋度的增加而減小，即原液注射點藍斑直徑最大，其他注射點依次減小。所有動物在原液、1:2注射點均出現(xiàn)藍斑，陽性反應率為100 %，各組動物在1:4、1:8注射點出現(xiàn)藍斑動物例數(shù)及陽性反應率不同，卵白蛋白10，20 mg/只劑量下的陽性反應率高于卵白蛋白5 mg/只劑量，但20 mg/只劑量下的原液注射點藍斑直徑過大，邊緣不易區(qū)分，10 mg/只劑量下的各注射點藍斑邊緣清晰，較易區(qū)分。在卵白蛋白劑量相同，致敏次數(shù)及末次致敏后抗血清制備時間不同時，各組在原液、1:2注射點陽性反應率并無明顯區(qū)別，均為100 %，但在1:4，1:8注射點陽性反應率存在差異，特別是5次致敏后第14天制備抗血清組，所有動物在1:8注射點均未出現(xiàn)藍斑。王沖等[16]研究發(fā)現(xiàn)，致敏8 d與致敏12～14 d的藍斑直徑比較差異無統(tǒng)計學意義，各組藍斑直徑并無明顯區(qū)別；井中旭等[17]研究發(fā)現(xiàn)，致敏效果與致敏次數(shù)不呈依賴關(guān)系，本研究結(jié)果也顯示致敏效果與致敏劑量相關(guān)，與致敏次數(shù)并無遞增關(guān)系，末次致敏后第10天制備抗血清的陽性反應要優(yōu)于末次致敏后第14天制備抗血清的陽性反應。藍繼奎等[18]研究表明，使用豚鼠進行被動皮膚試驗試驗時，增加免疫次數(shù)能提高陽性反應率，分析可能與動物種屬特異性有關(guān)。需要注意的是，大鼠腹腔注射致敏，由于佐劑的吸收速度慢，導致大鼠腹脹、腹腔內(nèi)腸黏膜粘連[10]，體重增長緩慢，致敏期間應密切關(guān)注動物狀態(tài)。

綜上，大鼠被動皮膚過敏試驗，致敏途徑為腹腔注射給藥時，推薦的方法為：SD大鼠連續(xù)隔日3次注射給予受試物與弗氏完全佐劑1:1混合乳液1 ml/只致敏，卵白蛋白致敏劑量10 mg/只，末次致敏后第10天取血制備抗血清?？寡灏丛?，1:2，1:4，1:8倍比稀釋，大鼠背部皮膚皮內(nèi)分別注射0.1 ml各濃度抗血清被動致敏，24 h后靜脈注射與致敏劑量相同抗原激發(fā)。