孫士健，王麗娟，秦酈，畢付提，王德培，3，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；3.省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

檸檬酸（citric acid）又名枸櫞酸，學(xué)名2-羥基丙烷-1，2，3-三羧酸，白色晶體，含一分子結(jié)晶水，無(wú)臭，具有令人愉快的強(qiáng)烈的酸味，入口爽快，無(wú)后酸味，安全無(wú)毒，被廣泛用作食品和飲料的酸味劑[1]。自1945年美國(guó)Miles公司借鑒深層發(fā)酵青霉素工廠，采用無(wú)菌空氣供給系統(tǒng)和機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的成功經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，首先成功開(kāi)發(fā)了深層發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)檸檬酸[2]。檸檬酸已成為全球產(chǎn)量和需求量最大的有機(jī)酸品種。世界檸檬酸工業(yè)的集約化程度非常高，除中國(guó)外，全球主要的檸檬酸制造商只有5家～6家[3]（美國(guó)、奧地利、加拿大、巴西等），而中國(guó)的產(chǎn)量為最大，2017年，全球檸檬酸及其鹽產(chǎn)量達(dá)到212萬(wàn)噸，我國(guó)產(chǎn)量達(dá)到152萬(wàn)噸，占全球近70%，是檸檬酸主要生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)。

國(guó)內(nèi)外檸檬酸工業(yè)化生產(chǎn)主要采用液體深層發(fā)酵法、表面發(fā)酵法及固體發(fā)酵法。上世紀(jì)90年代至今，我國(guó)利用玉米發(fā)酵檸檬酸，將玉米粉調(diào)漿，高溫液化加入高溫淀粉酶，快速過(guò)濾去除部分玉米渣后進(jìn)行發(fā)酵，使檸檬酸發(fā)酵過(guò)程溶氧好、產(chǎn)酸快、發(fā)酵周期短，單罐產(chǎn)酸提高到16%，發(fā)酵指數(shù)在2.4 kg/（m3·h）～2.8 kg/（m3·h）之間。決定檸檬酸產(chǎn)能優(yōu)勢(shì)的兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)是高產(chǎn)檸檬酸菌株和發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

自從上世紀(jì)初開(kāi)始用微生物生產(chǎn)檸檬酸以來(lái)，人們對(duì)生產(chǎn)檸檬酸的菌種進(jìn)行持續(xù)不斷的誘變研究。我國(guó)在檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉的育種方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，20世紀(jì)50年代末和60年代初，金其榮等進(jìn)行了檸檬酸發(fā)酵的菌種研究，從土壤中經(jīng)酸性平板分離獲得的野生黑曲霉628作為出發(fā)菌株，經(jīng)多次γ射線（Co60）和硫酸二乙脂等復(fù)合誘變，獲得了高產(chǎn)檸檬酸菌株Co827，可直接利用薯干粉發(fā)酵，產(chǎn)酸達(dá)12%～13%，平均轉(zhuǎn)化率為95%，發(fā)酵周期54 h～64 h，發(fā)酵指數(shù)1.8 kg/（m3·h）～2.0kg/（m3·h）[4]。無(wú)錫工業(yè)大學(xué)以黑曲霉H-142為出發(fā)菌株，通過(guò)γ射線、硫酸二乙脂、高溫單獨(dú)或復(fù)合誘變處理，通過(guò)高溫、高酸及高滲培養(yǎng)條件的定向篩選獲得HQL-601菌種，發(fā)酵溫度為40℃～41℃，周期60 h～64 h，20%薯干粉搖瓶產(chǎn)酸13%，其檸檬酸純度明顯優(yōu)于出發(fā)酵菌[5]。復(fù)合誘變的方法比用單一的物理方法或化學(xué)方法更為有效[6]。黑曲霉育種較為有效的誘變因子有：γ-射線、x-射線、紫外線、激光、亞硝基胍（nitroso-guanidin，NTG）、亞硝基脲、乙基胺等，此外還有高能電子流、電磁場(chǎng)等[7]。

本文以江蘇國(guó)信協(xié)聯(lián)能源有限公司天津分公司保藏的菌種zs-10為出發(fā)株，經(jīng)過(guò)γ射線（Co60）及亞硝基胍復(fù)合誘變，得到一株高產(chǎn)檸檬酸且遺傳穩(wěn)定性高的誘變菌株。通過(guò)對(duì)該菌株發(fā)酵工藝的優(yōu)化，提高了檸檬酸產(chǎn)量，縮短了發(fā)酵周期。試驗(yàn)結(jié)果在50 L發(fā)酵罐中試試驗(yàn)中得到驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）zs-10：江蘇國(guó)信協(xié)聯(lián)能源有限公司天津分公司保藏。

1.2 試劑

無(wú)水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、大豆蛋白胨：分析純，天津市北方天醫(yī)試劑公司；（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、KCl、FeSO4：分析純，天津市四通化工廠；玉米漿（試劑級(jí)）：金豐玉米有限公司；糖化酶（100 000 U/mL）：上海源葉生物科技有限公司；耐高溫的α-淀粉酶（20 000 U/mL）：諾和諾德（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；玉米蛋白粉、麩皮粉、豆餅粉：鄢陵勝源豆業(yè)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CX23型光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS公司；HZQ-QX恒溫振蕩器：中國(guó)哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；FA2004N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；50 L發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯削皮切塊，稱取200 g，加入適量蒸餾水煮沸30 min，4層紗布過(guò)濾除渣，取清液加蒸餾水定容至1L，加入2%葡萄糖充分溶解，加入瓊脂粉20 g，121℃，20 min滅菌。制成斜面或平板備用。

篩選培養(yǎng)基（g/L）[8]：馬鈴薯的煮汁 200 mL，K2HPO43.6 g，MgSO4·7H2O1.5 g，葡萄糖60 g，瓊脂20 g，溴甲酚綠0.05 g；121℃滅菌20 min；制成平板備用。

種子液培養(yǎng)基：4.8 g玉米粉，40 mL水，2滴耐高溫的α-淀粉酶加入250 mL三角瓶中，121℃滅菌0.5 h，冷卻后備用。

玉米液化液的制備：玉米粉與水以質(zhì)量比1∶4的比例混合，攪拌均勻后加熱到70℃，加入耐高溫α-淀粉酶（0.5 kg/t），保溫10 min后加熱到90℃保溫4 h～5 h，趁熱經(jīng)兩層紗布過(guò)濾得糖化清液。過(guò)濾清液冷卻后加水調(diào)整總糖到要求的濃度[9]。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：18%濃度玉米粉液化液，每250 mL三角瓶裝量35 mL液化液，1.93 g玉米粉末，1滴耐高溫的α-淀粉酶，121℃滅菌30 min，冷卻后備用。

1.5 誘變方法

1.5.1 孢子懸浮液的制備

用10 mL無(wú)菌水洗脫新鮮斜面孢子，置于預(yù)先滅菌的帶玻璃珠的20 mL無(wú)菌水中，于旋轉(zhuǎn)式搖床上180 r/min振蕩40 min至鏡檢為分散的單孢子，用兩層無(wú)菌濾紙加一層滅菌的脫脂棉過(guò)濾，得到單孢子懸液，將孢子懸液離心稀釋，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)單孢子懸液進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)孢子濃度約為106個(gè)/mL[10-11]。

1.5.2 γ射線（Co60）-亞硝基胍復(fù)合誘變

取106孢子/毫升Co60照射（劑量為1 400 Gy）輻照不同時(shí)間后的孢子懸浮液與亞硝基胍誘變劑混合不同時(shí)間，誘變后均與涂布于篩選平板，35℃恒溫培養(yǎng)60 h后進(jìn)行初篩。

1.6 篩選方法

1.6.1 誘變菌株的初篩

從經(jīng)過(guò)γ射線（Co60）-亞硝基胍復(fù)合誘變高濃度孢子液中取0.1 mL稀釋涂布于初篩平板中，以黑曲霉未經(jīng)離子注入的存活率為100%，將制好的平板與35℃培養(yǎng)36 h后開(kāi)始觀察，每6 h觀察1次，至產(chǎn)酸為止，統(tǒng)計(jì)致死率、突變率及正負(fù)突變率，挑取高產(chǎn)菌落于斜面上傳代培養(yǎng)。

致死率/%=（處理前菌落數(shù)-處理后菌落數(shù)）/處理前菌落數(shù)×100

突變率/%=突變菌落數(shù)/處理后菌落數(shù)×100

正突變率/%=發(fā)生正突變菌落數(shù)/處理后菌落數(shù)×100

負(fù)突變率/%=發(fā)生負(fù)突變菌落數(shù)/處理后菌落數(shù)×100

式中：突變菌落數(shù)為黃色透明圈直徑與對(duì)照樣相比出現(xiàn)差異的菌落數(shù)；發(fā)生正突變的菌落數(shù)為黃色透明圈直徑比對(duì)照樣大的菌落數(shù)；發(fā)生負(fù)突變的菌落數(shù)為黃色透明圈直徑比對(duì)照樣小的菌落數(shù)[12-13]。

1.6.2 誘變菌株的復(fù)篩

從初篩得到的斜面菌株上挑取適量的黑曲霉孢子于總糖為18%的玉米發(fā)酵液中，500 mL三角瓶中裝入50 mL培養(yǎng)液，搖床轉(zhuǎn)速350 r/min，36℃振蕩培養(yǎng)72 h。測(cè)定發(fā)酵液總酸。

1.7 檸檬酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.7.1 種子液的培養(yǎng)條件

1.7.1.1 種子培養(yǎng)氮源種類優(yōu)化

氮源分別為玉米蛋白粉、麩皮粉、豆餅粉，分別稱取一定量溶于50 mL水中，2滴液化酶，121℃滅菌30 min，冷卻后接入1環(huán)黑曲霉孢子于250 mL三角瓶中，搖床200 r/min，35℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定種子液中18 h pH值并觀察菌球形態(tài)。

1.7.1.2 種子培養(yǎng)總糖源濃度優(yōu)化

在氮源一定的情況下，將種子液總糖濃度分別調(diào)至3%、6%、10%、15%、20%，50mL種子培養(yǎng)液，121℃滅菌30 min，冷卻后接入1環(huán)黑曲霉孢子于250 mL三角瓶中，搖床200 r/min，35℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定種子液中菌球數(shù)量。

1.7.2 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

1.7.2.1 溫度對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

采用搖瓶培養(yǎng)基，無(wú)菌接入一環(huán)孢子，分別在溫度為 26、29、32、35、38 ℃條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為350 r/min，發(fā)酵72 h后測(cè)定不同溫度條件下的發(fā)酵液中總酸的含量，確定黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的最適溫度。

1.7.2.2 初始pH值對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

調(diào)整搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別為2.5、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 后滅菌。無(wú)菌環(huán)境下接入一環(huán)黑曲霉孢子，在35℃發(fā)酵72 h后測(cè)定不同初始pH值條件下檸檬酸的生成量，確定檸檬酸發(fā)酵的最適初始pH值。

1.7.2.3 氮源種類對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同種類的蛋白質(zhì)含量為0.6%的氮源后滅菌，氮源分別為蛋白胨、玉米漿、豆餅粉、硫酸銨、尿素、氯化銨、硝酸銨，在35℃發(fā)酵72 h后測(cè)定在不同的氮源條件下發(fā)酵液中總酸的含量，確定檸檬酸發(fā)酵的最適氮源。

1.7.2.4 氮源含量對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同含量的最適氮源后滅菌，氮源加量為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，35℃發(fā)酵72 h后測(cè)定在最適氮源的不同含氮量下發(fā)酵液中檸檬酸的含量，確定檸檬酸發(fā)酵的最適氮源的用量。

1.8 50L發(fā)酵罐中試試驗(yàn)

將7.84 kg玉米粉與水混合至28 L，加入液化酶進(jìn)行液化，液化后過(guò)濾后取清液21 L，再加入30%濃度玉米液化混液4.5 L作為氮源，采用二級(jí)接種，10%接種量，發(fā)酵溫度35℃，罐壓0.08 MPa，通氣量0.12 V/V·M～0.15 V/V·M （V/V·M 表示通風(fēng)比），轉(zhuǎn)速350 r/min。

1.9 分析方法

1.9.1 還原糖和總糖的測(cè)定

采用菲林法測(cè)定。

1.9.2 發(fā)酵液中總酸的測(cè)定

取1 mL發(fā)酵過(guò)濾液于250 mL錐形瓶中，再加入約100 mL蒸餾水，加入2滴0.1%酚酞指示劑，用0.142 9 mol/L的NaOH溶液滴定至變紅為止，記錄所消耗NaOH溶液的體積V[14]。

式中：V為滴定時(shí)消耗NaOH的體積，mL；0.142 9為滴定系數(shù)。

1.10 數(shù)據(jù)處理方法

Excel 2007數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，SPSS17.0軟件進(jìn)行單因子方差分析

2 結(jié)果與討論

2.1 Co60與亞硝基胍復(fù)合誘變黑曲霉

2.1.1 γ 射線（Co60）誘變

由于此前黑曲霉zs-10是經(jīng)過(guò)γ射線（Co60）誘變后篩選得到的菌株，因此采用高劑量γ射線（Co60）進(jìn)行孢子懸浮液誘變，選用γ射線（Co60）處理的劑量分別為 1000、1200、1400 Gy，其致死率與正突變率見(jiàn)表 1。

表1 不同劑量下Co60誘變黑曲霉的致死率及正突變率Table1 Death rate and positive rate of Co60mutagenesis Aspergillus niger at different doses

由表1可以看出，Co60誘變的致死率和菌種正變率都隨著處理時(shí)間的增加而升高，在處理劑量為1 400 Gy時(shí)，正變率達(dá)到30.6%。所以選取誘變劑量為1 400 Gy。

2.1.2 亞硝基胍誘變黑曲霉

NTG誘變孢子存活率與時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1 NTG誘變孢子存活率與時(shí)間的關(guān)系Fig.1 Relation between the survival rate of NTG mutagenesis spores and time

由圖1可以看出，隨著NTG誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株存活率在下降。當(dāng)誘變時(shí)間為4 min時(shí)存活率為25%，致死率在75%左右。因此當(dāng)用濃度為1 mg/mL的NTG做誘變劑時(shí)，誘變時(shí)間為4 min。

2.1.3 Co60與亞硝基胍復(fù)合誘變

通過(guò)Co60和亞硝基胍單獨(dú)誘變確定最適的誘變劑量，進(jìn)行Co60與亞硝基胍復(fù)合誘變黑曲霉孢子。通過(guò)挑選圏徑比大的菌株進(jìn)行初篩，初篩后得到30株然后進(jìn)行第一輪復(fù)篩結(jié)果見(jiàn)表2，將第一輪復(fù)篩產(chǎn)酸高于15.2 g/dL菌株進(jìn)行第二輪復(fù)篩見(jiàn)表3。

表2 誘變黑曲霉孢子復(fù)篩結(jié)果Table 2 Results of mutagenic Aspergillus niger spore screening

表3 誘變黑曲霉孢子二次復(fù)篩結(jié)果Table 3 Secondary screening results of mutagenic Aspergillus niger spores

通過(guò)表2和表3可以看出，經(jīng)過(guò)二次復(fù)篩得到平均產(chǎn)酸為15.5 g/dL的菌株zs-10-5，接下對(duì)其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行考察。黑曲霉zs-10-5的傳代培養(yǎng)情況見(jiàn)表4。

表4 黑曲霉zs-10-5的傳代培養(yǎng)情況Table 4 Subculture of Aspergillus niger zs-10-5

從表4可以看出，經(jīng)過(guò)10次傳代培養(yǎng)后，黑曲霉zs-10-5仍保留了較高產(chǎn)酸能力，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩和傳代培養(yǎng)，獲得產(chǎn)酸有較大提高且遺傳性狀穩(wěn)定的突變株zs-10-5。

2.2 種子液的培養(yǎng)條件

2.2.1 氮源對(duì)種子的影響

種子搖瓶中添加不同的氮源對(duì)種子發(fā)酵液的pH值，菌球的形成時(shí)間及菌球的形態(tài)產(chǎn)生了不同的影響結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 氮源對(duì)種子的影響Table 5 Influence of nitrogen source on seed

由表5可以看出，添加豆餅粉的種子液菌種生長(zhǎng)較快，在同樣時(shí)間下pH值下降幅度大，因此，在使用豆餅粉的工藝中，可以縮短種子的培養(yǎng)時(shí)間3 h～4 h，而且菌球形態(tài)有利于發(fā)酵。

2.2.2 碳源濃度對(duì)種子的影響

種子液的初糖濃度的高低直接影響黑曲霉菌體的生長(zhǎng)與發(fā)育，影響產(chǎn)酸效率。從黑曲霉發(fā)酵檸檬酸的過(guò)程分析，如果種子液初糖濃度過(guò)高，會(huì)對(duì)孢子的生長(zhǎng)發(fā)育有抑制作用。同時(shí)過(guò)高的糖濃度還會(huì)使發(fā)酵培養(yǎng)基濃度過(guò)高，嚴(yán)重影響發(fā)酵液溶氧。由于種子生長(zhǎng)初期，孢子發(fā)育耗氧量非常大，所以種子液初期糖濃度過(guò)高會(huì)嚴(yán)重影響菌絲球成型。但是，如果種子液初總糖過(guò)低，則菌絲球會(huì)長(zhǎng)的很大，且形狀不規(guī)則，生長(zhǎng)不正常。以下是不同糖濃度下，菌球生長(zhǎng)情況。糖濃度與菌球數(shù)的關(guān)系見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出在一定范圍內(nèi)隨著糖濃度的升高菌球數(shù)也隨之增加，當(dāng)糖濃度為10%時(shí)，菌球數(shù)達(dá)到最大值。糖濃度超過(guò)10%時(shí)，菌球數(shù)隨之下降，說(shuō)明糖濃度過(guò)大會(huì)抑制孢子的萌發(fā)和菌球的形成。

圖2 糖濃度與菌球數(shù)的關(guān)系Fig.2 Relationship between sugar concentration and mycosphere number

2.3 黑曲霉檸檬酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1 溫度對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

溫度是影響黑曲霉發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要因素。溫度過(guò)低，細(xì)胞內(nèi)控制酶合成的關(guān)鍵酶的活性受到抑制，合成檸檬酸的生物反應(yīng)趨向停滯狀態(tài)，溫度偏高，可能會(huì)造成微生物細(xì)胞中關(guān)鍵酶的不可逆失活，是微生物代謝減慢。在不同的溫度下，黑曲霉發(fā)酵72 h后檸檬酸的生成情況見(jiàn)圖3。

圖3 不同溫度對(duì)黑曲霉產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effects of different temperatures on acid production by Aspergillus niger

從圖3可以看出，黑曲霉進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵時(shí)，在26℃～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，發(fā)酵液中檸檬酸的含量逐漸升高，當(dāng)溫度大于35℃時(shí)，發(fā)酵液中檸檬酸的含量明顯降低，因此黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸的最適溫度為35℃。

2.3.2 初始pH值對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的搖床三角瓶發(fā)酵，調(diào)節(jié)合適的發(fā)酵初始pH值十分重要。特別是像檸檬酸發(fā)酵這種以淀粉作為發(fā)酵原料的發(fā)酵，發(fā)酵液初始pH值的高低會(huì)直接影響到菌體糖化酶的活力，由于檸檬酸發(fā)酵是以玉米粉為原料的發(fā)酵過(guò)程，屬于邊糖化邊生長(zhǎng)邊產(chǎn)酸的過(guò)程。初始pH值過(guò)低，會(huì)直接導(dǎo)致糖化酶活性低，淀粉不能完全水解，反之如果發(fā)酵液初始pH值較高，會(huì)使發(fā)酵過(guò)程中草酸和葡萄糖酸大量積累，使發(fā)酵液中雜酸含量過(guò)高。不同發(fā)酵液初始pH值對(duì)檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同pH值對(duì)黑曲霉的產(chǎn)酸影響Fig.4 Effects of different pH on acid production by Aspergillus niger

如圖4所示，黑曲霉在進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵時(shí)，只有發(fā)酵液初始pH值為5～6時(shí)，產(chǎn)酸最高。究其原因主要是，糖化酶的活性最高pH值為4.0～4.6，如果起始pH值低于糖化酶的作用最適范圍，會(huì)使得發(fā)酵原料得不到充分利用，進(jìn)而影響最終產(chǎn)酸率。反之如果發(fā)酵液初始pH值過(guò)高，則黑曲霉菌絲球會(huì)出現(xiàn)老化現(xiàn)象，提前進(jìn)入衰老期。所以，發(fā)酵液初始最適pH值為5～6。

2.3.3 氮源種類對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

菌體利用發(fā)酵液中的氮源是為了合成自身生長(zhǎng)發(fā)育所需要的各種蛋白質(zhì)、核酸和各種氨基酸。在菌體的生長(zhǎng)過(guò)程中，不同菌體利用各種有機(jī)氮或無(wú)機(jī)氮的種類是不同的。但是黑曲霉的生長(zhǎng)過(guò)程比較粗放，可以利用各種有機(jī)或無(wú)機(jī)氮源作為其自身氮源。檸檬酸產(chǎn)酸與氮源種類的關(guān)系見(jiàn)圖5。

結(jié)果如圖5所示，以豆餅粉為氮源時(shí)菌株的產(chǎn)酸能力高于其它氮源。

圖5 檸檬酸產(chǎn)酸與氮源種類的關(guān)系Fig.5 Relation between citric acid production and nitrogen source species

2.3.4 氮源含量對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

檸檬酸產(chǎn)酸與氮源含量的關(guān)系見(jiàn)圖6。

圖6 檸檬酸產(chǎn)酸與氮源含量的關(guān)系Fig.6 Relation between acid production and nitrogen source content

從圖6可以看出，黑曲霉進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵時(shí)，當(dāng)?shù)吹挠昧繛?.8%時(shí)，檸檬酸的產(chǎn)量最高。因此，在以豆餅粉為氮源的條件下，黑曲霉利用進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸的最適氮源含量為0.8%。

2.4 50 L發(fā)酵罐中試試驗(yàn)

50 L中試試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 50L中試試驗(yàn)結(jié)果Table 6 50L pilot test results

由表6可以看出，通過(guò)優(yōu)化檸檬酸發(fā)酵工藝，中試罐發(fā)酵產(chǎn)酸17.94%，周期63 h、發(fā)酵指數(shù)2.85 kg/（m3·h）及轉(zhuǎn)化率99.7%都達(dá)到較好的發(fā)酵水平。

3 結(jié)論

以菌種zs-10為出發(fā)株，經(jīng)過(guò)γ射線（Co60）及亞硝基胍復(fù)合誘變，得到一株高產(chǎn)檸檬酸且遺傳穩(wěn)定性高的誘變菌株zs-10-5。通過(guò)對(duì)種子培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)種子以豆餅粉為氮源，初總糖濃度10%培養(yǎng)24 h左右形成菌絲球性能最好。發(fā)酵最適溫度35℃，初始發(fā)酵在pH5～6，以豆餅粉為氮源為0.8%，通過(guò)50 L發(fā)酵罐進(jìn)行了驗(yàn)證，其發(fā)酵結(jié)果為周期63 h，產(chǎn)酸17.94 g/100 mL，發(fā)酵指數(shù)為2.85 kg/（m3·h），轉(zhuǎn)化率為99.7%。比出發(fā)菌株發(fā)酵周期縮短3 h，產(chǎn)酸提高10%，轉(zhuǎn)化率提高5%。