母應(yīng)春，姜麗，禹曉婷，蘇偉，母雨

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

黑糯米是水稻品種中的珍貴品種，被譽(yù)為“高原黑珍珠”[1-2]。黑糯米多屬粳型糯稻，其米皮呈烏黑或黑、紫黑、褐黑或棕黑，具有附著力極強(qiáng)的紫色素，對(duì)幾種急性心肌缺氧、缺血等有明顯保護(hù)作用。同時(shí)黑糯米有顯著的藥用功效，也稱為“藥米”，具有補(bǔ)中益氣、滋陰益腎、補(bǔ)胃暖肝、益精補(bǔ)肺、寒泄痢等功效[3-4]。有研究表明，米酒中含有大量的多酚、黃酮及多糖等物質(zhì)，因?yàn)槠漭^強(qiáng)的清除自由基和抗氧化等功能性作用[5-6]，其中的多酚類物質(zhì)已經(jīng)成為黃酒研究的熱點(diǎn)。

趙旭等[7]以糖化酶協(xié)同微生物釀造黑糯米酒，得到了較傳統(tǒng)工藝相比更高品質(zhì)的黑糯米酒。齊琦等[8]以黑糯米為原料，釀制而成的酒精度低和糖分含量高的一種特色美酒。同時(shí)齊琦等[9]也以12 種藥食同源藥材，經(jīng)過(guò)粉碎混合以后加入黑糯米酒中同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，制成了黑糯米保健酒，具有補(bǔ)肝腎、健脾等作用。制曲添加中藥材由來(lái)已久[10]，本試驗(yàn)將12 種藥食同源物質(zhì)制成酒曲后用于黑糯米酒發(fā)酵，旨在抑制發(fā)酵體系中雜菌生長(zhǎng)，還可以在微生物作用下使藥材中的有益物質(zhì)充分釋放，豐富黑糯米酒中功能性成分含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑糯米：貴州省永紅酒業(yè)有限公司；新基質(zhì)曲（以山藥、干姜、芡實(shí)、桑葚子、人參、枸杞、酸棗仁、牛蒡根、沙棘、覆盆子、瑪卡、甘草12 種物質(zhì)制得）：奧淼中藥材；沒(méi)食子酸、福林酚試劑、碳酸鈉、乙醇（均為分析級(jí)）：貴州慕為美生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L5S 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；UX220H 電子天平：廈門欣銳儀器儀表有限公司；DHP-420 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；HH6 電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑糯米酒發(fā)酵工藝流程

選用無(wú)發(fā)霉、無(wú)蟲蛀及顆粒飽滿的黑糯米。將黑糯米浸泡至米粒帶有裂紋后蒸煮30 min，以涼白開(kāi)淋米冷卻；加入以藥食同源物質(zhì)所制得的酒曲進(jìn)行發(fā)酵，將發(fā)酵后的酒液以4 000 r/min 離心30 min，澄清后以0.45 μm 的微孔膜過(guò)濾后進(jìn)行灌裝。70 ℃條件下保溫15 min 進(jìn)行滅菌。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以總酚含量、感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察發(fā)酵時(shí)間（4、5、6、7、8、9 d）、發(fā)酵溫度（24、28、30、34、37 ℃）、新基質(zhì)曲添加量（6%、8%、10%、12%、15%、20%）、泡米時(shí)間（0、3、5、7、9 h）對(duì)黑糯米酒品質(zhì)的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以（A）發(fā)酵時(shí)間、（B）發(fā)酵溫度、（C）新基質(zhì)曲添加量、（D）泡米時(shí)間度為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素選擇3 個(gè)水平，以黑糯米酒的總酚含量、感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)確定黑糯米酒的最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 黑糯米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of black glutinous rice wine

1.3.4 黑糯米酒感官方法

產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)參考文獻(xiàn)[11-12]和GB/T13662-2018《黃酒》：根據(jù)黑糯米酒的形態(tài)色澤、香氣香味、酒體滋味及風(fēng)格為評(píng)分項(xiàng)目，由10 名專業(yè)人士組成的品評(píng)小組進(jìn)行綜合感官評(píng)價(jià)后進(jìn)行打分，滿分為100 分，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 黑糯米保健酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of black glutinous rice wine

1.3.5 總酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu 比色法[13]測(cè)定總酚含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0 和IBM SPSS Statistics 25 進(jìn)行圖像繪制及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 黑糯米酒釀酒工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酚含量及感官評(píng)分的影響

在新基質(zhì)曲添加量為15%，泡米時(shí)間為5 h，發(fā)酵溫度為 30 ℃的條件下，發(fā)酵時(shí)間分別為 4、5、6、7、8、9 d，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑糯米酒總酚含量和感官評(píng)分的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑糯米酒總酚含量和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of fermentation time on total phenol content and sensory score of black glutinous rice wine

由圖2可知，總酚含量隨著發(fā)酵時(shí)間增加而增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間到7 d 時(shí)，總酚含量達(dá)到最高0.643 mg/mL，但是感官評(píng)分在8 d 時(shí)感官評(píng)分值達(dá)到最大84 分。發(fā)酵初期，在酵母和霉菌作用下，黑糯米和藥材中的多酚溶于發(fā)酵液中，在發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量增加，酚類物質(zhì)中部分屬于醇溶性，可能導(dǎo)致總酚含量降低[14-15]。研究表明，酚類物質(zhì)可以在多級(jí)反應(yīng)中被氧化[16]，這也可能是造成其含量降低的原因。綜合以上因素，因此選擇6、7、8 d 發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)總酚含量及感官評(píng)分的影響

在泡米時(shí)間5 h，新基質(zhì)曲添加量為15%，發(fā)酵時(shí)間為 7 d 的條件下，發(fā)酵溫度分別為 24、28、30、34、37 ℃，研究發(fā)酵溫度對(duì)黑糯米酒總酚含量和感官評(píng)分的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)黑糯米酒總酚含量及感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on total phenol content and sensory score of black glutinous rice wine

由圖3可知，黑糯米酒總酚含量和感官評(píng)分均隨著發(fā)酵溫度的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度34 ℃時(shí)，兩者達(dá)到最大分別為0.565 mg/mL 和83分。這是由于酶促反應(yīng)中溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響較大，在適宜溫度時(shí)，酶促反應(yīng)才能達(dá)到最佳[17-19]。因此選擇發(fā)酵溫度30、34、37 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.1.3 新基質(zhì)曲添加量對(duì)總酚含量及感官評(píng)分的影響

在發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵溫度為30 ℃，泡米時(shí)間5 h的條件下，新基質(zhì)曲添加量分別為6%、8%、10%、12%、15%、20%，研究新基質(zhì)曲添加量對(duì)黑糯米酒總酚酮含量和感官評(píng)分的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 新基質(zhì)曲添加量對(duì)黑糯米酒總酚含量及感官評(píng)分的影響Fig.4 Effects of new matrix koji on total phenol content and sensory score of black glutinous rice wine

由圖4可知，黑糯米酒感官評(píng)分隨著新基質(zhì)曲添加量的增加總體呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)新基質(zhì)曲添加量達(dá)到15%時(shí)，感官評(píng)分最高為82.6 分。這可能是新基質(zhì)曲為藥食同源物質(zhì)所制，添加量小，藥香味不足，口感清淡，添加過(guò)量會(huì)導(dǎo)致藥味過(guò)濃，影響口感[18]。在新基質(zhì)曲添加量為6%～10%的范圍內(nèi)總酚含量變化不大，新基質(zhì)曲添加量大于10%后總酚含量呈先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)新基質(zhì)曲添加量達(dá)到15%時(shí)，總酚含量最高為0.845 mg/mL。這是因?yàn)樾禄|(zhì)曲為藥食同源基質(zhì)制得，酚類物質(zhì)含量較豐富，因此總酚會(huì)隨著新基質(zhì)曲添加量的增加而增加，隨著發(fā)酵進(jìn)行，酚類物質(zhì)在發(fā)酵液中趨于飽和，但隨著乙醇增多，其他醇溶性物質(zhì)溶出增多，酚類物質(zhì)被氧化，使得總酚含量下降。因此選擇新基質(zhì)曲添加量12%、15%、20%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.1.4 泡米時(shí)間對(duì)黑糯米酒總酚含量及感官評(píng)分的影響

在新基質(zhì)曲添加量為15%，發(fā)酵時(shí)間為7 d，發(fā)酵溫度 30 ℃條件下，泡米時(shí)間分別為 0、3、5、7、9 h，研究泡米時(shí)間對(duì)黑糯米酒總酚含量和感官評(píng)分的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 泡米時(shí)間對(duì)黑糯米酒總酚含量及感官評(píng)分的影響Fig.5 Effects of soaking time on total phenol content and sensory score of black glutinous rice wine

由圖5可知，黑糯米酒感官評(píng)分隨著泡米時(shí)間增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)泡米時(shí)間在7 h 時(shí)，分?jǐn)?shù)最高86 分，總酚含量在泡米5h 時(shí)達(dá)到最大0.591 mg/mL。泡米時(shí)間短，米粒過(guò)硬導(dǎo)致蒸煮不完全，發(fā)酵時(shí)酚類物質(zhì)無(wú)法更好溶解除，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，米皮表面花青素隨著水流失，導(dǎo)致酚類物質(zhì)減少[20]。因此選擇泡米時(shí)間3、5、7 h 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3。

由表3可知，影響黑糯米酒總酚含量的各因素的主次順序?yàn)镈＞C＞A＞B，影響黑糯米酒感官品質(zhì)的各因素的順序?yàn)?A＞D＞C＞B。

2.2.2.2 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

以總酚含量和感官評(píng)定為評(píng)價(jià)指標(biāo)的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表3 黑糯米酒發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of black glutinous rice wine

表4 以總酚為評(píng)價(jià)指標(biāo)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using total phenol content as evaluation index

表5 以感官評(píng)定為評(píng)價(jià)指標(biāo)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results using sensory evaluation as evaluation index

續(xù)表5 以感官評(píng)定為評(píng)價(jià)指標(biāo)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Continue table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results using sensory evaluation as evaluation index

由表4可知，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、新基質(zhì)曲添加量、泡米時(shí)間均對(duì)黑糯米保健酒總酚含量和感官評(píng)分均有顯著性影響（P＜0.05）。以總酚含量為指標(biāo)時(shí)，配方的最優(yōu)組合為A1B2C3D3，以感官評(píng)分為指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)組合為A2B2C2D2。根據(jù)K 值的大小比較，以及綜合分析認(rèn)為，黑糯米酒發(fā)酵的最優(yōu)參數(shù)為A1B2C2D3，即發(fā)酵時(shí)間6 d，發(fā)酵溫度34 ℃，新基質(zhì)曲添加量15%，泡米時(shí)間7 h，在此條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，得黑糯米酒感官評(píng)分為86 分，總酚含量為0.85 mg/mL。

3 結(jié)論

本研究以枸杞、山藥、覆盆子等12 種藥食同源物質(zhì)為基質(zhì)制成的酒曲為發(fā)酵曲，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)黑糯米酒的釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵時(shí)間6 d，發(fā)酵溫度34 ℃，新基質(zhì)曲添加量15%，泡米時(shí)間7 h。在此優(yōu)化條件下得到感官評(píng)分為86 分，總酚量為0.85 mg/mL 的黑糯米酒，釀造的米酒具有柔和色澤和黃酒特有的醇香，甜潤(rùn)爽口且具有一定的保健功能。