鄧詩貴，楊晨軍，馮加洲，吳曉玉

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的重要組成部分，是一種非多糖高分子物質(zhì)，在自然界中的產(chǎn)量僅次于纖維素[1]。木質(zhì)素主要由愈創(chuàng)木基丙烷單元、紫丁香基丙烷單元和對羥基苯丙烷單元通過碳碳鍵和醚鍵聯(lián)接聚合而成[2]，分子量 600 kDa～1 500 kDa[3]。木質(zhì)素主要存在于植物的木質(zhì)結(jié)構(gòu)中，使細(xì)胞壁硬化，增加細(xì)胞的剛性[4]。在植物細(xì)胞壁中，木質(zhì)素和半纖維素之間相互作用形成牢固的結(jié)合層將纖維素包埋其中，由于木質(zhì)素的非水溶性，使酶與纖維素不能良好接觸，限制了消化酶對細(xì)胞壁及細(xì)胞內(nèi)容物的分解功能[5]。木質(zhì)素是所有天然有機(jī)產(chǎn)物中最難降解的物質(zhì)[6]。

相關(guān)研究表明，木質(zhì)素采用物理法、化學(xué)法處理時(shí)存在能耗高、“二次污染”等缺陷；而微生物降解木質(zhì)素具有專一性強(qiáng)和無環(huán)境污染等特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景[7]。自然環(huán)境下，木質(zhì)素降解是由多種微生物共同作用的結(jié)果，降解能力由強(qiáng)到弱依次為真菌、放線菌和細(xì)菌。真菌中屬白腐菌對木質(zhì)素降解能力最強(qiáng)，可以將木質(zhì)素完全降解為CO2和H2O[8]。白腐菌在降解天然木質(zhì)纖維素時(shí)，先降解半纖維素，以產(chǎn)生大量的碳源供菌絲生長，然后開始降解木質(zhì)素，最后半纖維素、木質(zhì)素和纖維素三者同時(shí)被降解[9]。

木質(zhì)素高聚物在微生物產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶作用下，斷裂結(jié)構(gòu)單元間連接鍵，從而分解為低分子物質(zhì)。木質(zhì)素降解酶系主要包括漆酶（laccases，Lac）、錳過氧化物酶（manganese peroxidase，Mnp）和木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase，Lip）。漆酶在降解木質(zhì)素時(shí)，同時(shí)催化解聚和聚合反應(yīng)；在Lip 或Mnp 等其他酶協(xié)同作用時(shí)，以抑制產(chǎn)物重新聚合，會(huì)提高木質(zhì)素降解效率[10-11]。漆酶廣泛用于染料脫色，紙漿漂白以及畜牧業(yè)生產(chǎn)中。本研究從鐵皮石斛生長的樹皮中篩選到1 株產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的真菌——白黃小脆柄菇，并對其產(chǎn)漆酶條件進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)白腐菌漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基（g/L）：去皮馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂20；苯胺藍(lán)-PDA 培養(yǎng)基：滅菌后添加用無菌過濾器加入0.1 g/L 苯胺藍(lán)[12]；愈創(chuàng)木酚-PDA 培養(yǎng)基：滅菌加入0.4%的愈創(chuàng)木酚[13]；初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：去皮馬鈴薯 200，葡萄糖 20，蛋白胨 2，KH2PO41，酒石酸銨0.02，CuSO40.01，MgSO40.3，MnSO40.03。

1.1.2 主要試劑與儀器

葡萄糖、蛋白胨、乙酸、乙酸鈉、酒石酸銨、KH2PO4、MnSO4、CuSO4、MgSO4：西隴化工股份有限公司，以上化學(xué)試劑皆為分析純；ABTS：aladdin 公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑及擴(kuò)增引物：湖南擎科生物技術(shù)有限公司；SW-CJ-1D 型超凈作臺(tái)：江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠；SKY-2112B 型恒溫雙層搖床：上海蘇坤儀器儀表有限公司。

1.2 菌種分離

取1 g 鐵皮石斛生長的腐木用研缽研碎，加入9 mL的無菌水稀釋，放入200 r/min 的振蕩器中振蕩1 h，制成10-1腐木懸液，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，依次10 倍遞增系列稀釋至10-6，每個(gè)梯度的樣品取100 μL 接種到苯胺藍(lán)-PDA 培養(yǎng)基上，置于 30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d，后挑取在苯胺藍(lán)-PDA 平板上有退色變化的單一菌種再接種到愈創(chuàng)木酚-PDA 培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)基中苯胺藍(lán)和愈創(chuàng)木酚分別可以檢測過氧化物酶和漆酶的產(chǎn)生與否，通過兩種培養(yǎng)基可以得到同時(shí)產(chǎn)過氧化物酶和漆酶的菌株。

1.3 菌種的鑒定

在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)選出的單一菌株轉(zhuǎn)接至PDA 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 d～7 d，挑取菌絲在顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)。

挑取篩選出的菌株的菌絲采用CTAB 法提取總DNA，采用真菌通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：PCR Mix 25 μL，ITS1（10 μmol/L）2μL，ITS4 （10 μmol/L）2 μL，Template 1 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件：①98 ℃，2 min，②98 ℃，10 s，54 ℃，10 s，72 ℃，10 s，35 個(gè)循環(huán)，③72 ℃，5 min。引物合成和 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測序由湖南擎科生物技術(shù)有限公司完成。菌株序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行相似性分析，并加入Phanerochaete chrysosporium （黃孢原毛平革菌——白腐真菌中對木質(zhì)素降解研究最透徹的模式菌株[8，14]）的rDNA-ITS 基因序列作為外參，并用MEGA 6.06 軟件包中 Neighbor-joining （kimura'2-parameter modle，bootstrap 1000）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株液體發(fā)酵

保藏于PDA 斜面的菌株SHIHU-X2，經(jīng)新制的PDA 培養(yǎng)基平板上活化，28 ℃下培養(yǎng)7 d，在菌株活化后的平板上用無菌打孔器制造出直徑為5 mm×5 mm菌塞塊，將10 個(gè)菌塊轉(zhuǎn)接到50 mL 的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中（250 mL 三角瓶），30 ℃搖床培養(yǎng) 5 d，5 000 r/min，離心10 min 取上清液測定木質(zhì)素降解酶活力。

1.5 木質(zhì)素降解酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

對初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵液Mnp、Lip 和Lac 進(jìn)行測定，比較3 種木質(zhì)素降解酶活的大小，確定以漆酶產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)來優(yōu)化SHIHU-X2 產(chǎn)木質(zhì)素降解酶培養(yǎng)基。

1.5.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman 試驗(yàn)可以快速地從眾多的因素中有效地確定最主要的幾個(gè)因素，供進(jìn)一步研究[15]。分別從蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、酒石酸銨 CuSO46 個(gè)因素中篩選出對菌株SHIHU-X2 產(chǎn)漆酶影響最重要的幾個(gè)因素。采用Design-Expert 8.0.5 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)行N=12 次試驗(yàn)，其中添加5 組為虛擬變量，以漆酶產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)因子水平及編碼Table 1 The two levels of variables used in the Plackett-Burman design

1.5.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果得到3 個(gè)對白黃小脆柄菇產(chǎn)Lac 關(guān)鍵因素為蛋白胨、MgSO4和MnSO4，KH2PO4、酒石酸銨和CuSO4取初始濃度，然后按梯度減少蛋白胨的濃度，并按梯度增加MgSO4和MnSO4的濃度，測定發(fā)酵液的Lac 活力的變化，從而確定此3個(gè)因素的最適濃度范圍。

1.5.3 Box-Behnken 設(shè)計(jì)

以Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選得到的對發(fā)酵液的Lac 影響顯著的因素作為設(shè)計(jì)因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得出的濃度作為中心點(diǎn)，根據(jù)表2進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)行三因素三水平，共17 個(gè)試驗(yàn)組響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以發(fā)酵液的漆酶產(chǎn)量為響應(yīng)值。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)水平表Table 2 Levels of variables used in the Box-Behnken design

1.6 酶活的測定

取1 mL 發(fā)酵液用蒸餾水稀釋10 倍后測定其木質(zhì)素降解酶活力，以沸水浴30 min 的酶液作空白對照。木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）活力測定用黎蘆醇法[16]，錳過氧化物酶（Mnp）活力測定用 MnSO4法[17]，漆酶（Lac）活力測定用ABTS 法[18]。酶活力定義為每分鐘氧化1 μmol底物所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）。

酶活的計(jì)算方法：酶活力（U/mL）=（ΔOD×106×n×10-3）/（Δt×ξ）。式中：n 為發(fā)酵液稀釋倍數(shù)；ΔOD 為吸光度變化；106為將 mol 換算成 μmol 的系數(shù)；Δt 為反應(yīng)時(shí)間，min；ξ 為摩爾消光數(shù)，L/（M·cm）；ABTS 氧化產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)為3.6×104L/（M·cm），三價(jià)錳離子的摩爾吸光系數(shù)為8.1×103L/（M·cm），藜蘆醛的摩爾吸光系數(shù)9.3×103L/（M·cm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)纖維素降解菌的篩選結(jié)果

苯胺藍(lán)脫色法對檢測降解木質(zhì)素的過氧化物酶類專一性強(qiáng)，能有效的檢測出木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶等過氧化物類型酶[19]。愈創(chuàng)木酚定性的測定菌株是否能降解木質(zhì)素具有漆酶活性的菌株，可在菌落周圍形成鮮艷而均勻的紅棕色氧化圈，氧化圈的大小和顏色的深淺可以很好地反映出漆酶的活性大小[20-21]。菌株SHI-X2 在苯胺藍(lán)-PDA 平板上的退色和愈創(chuàng)木酚-PDA 平板顯色反應(yīng)見圖1。

圖1 苯胺藍(lán)-PDA 平板褪色反應(yīng)和愈創(chuàng)木酚-PDA 平板顯色反應(yīng)圖Fig.1 Fading reaction on aniline blue-PDA plates and color reaction on guaiacol-PDA plates

由圖1可知，愈創(chuàng)木酚對SHI-X2 有一定的抑制作用，在愈創(chuàng)木酚-PDA 平板上生長緩慢，但紅棕色圏比菌落大很多，說明可以產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)；在苯胺藍(lán)-PDA 平板生長正常，裸色圈直徑大于菌落直徑，說明具有良好的產(chǎn)降解木質(zhì)素過氧化物酶的能力。

2.2 SHIHU-X2的鑒定

顯微鏡觀察菌絲狀況如圖2所示。

圖2 SHIHU-X2 的菌絲Fig.2 The mycelium of SHIHU-X2

SHIHU-X2 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：菌株SHIHU-X2 在培養(yǎng)的過程，菌落中心突起，菌絲呈白色。

將菌株ITS1～I(xiàn)TS4 序列測定結(jié)果與2018年4月的NCBI 中數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTn 序列比對分析，選取結(jié)果中相似度最高的菌屬作為對應(yīng)菌株分類標(biāo)準(zhǔn)，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖3。

圖3 菌株SHIHU-X2 基于ITS1～I(xiàn)TS4 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic position based on ITS1-ITS4 sequences of strain SHIHU-X2

利用MEGA 6.06 構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株SHIHU-X2 的 ITS1～I(xiàn)TS4 序列基因序列與 Psathyrella屬的菌株rDNA-ITS 基因序列相似度為99%，與登入號(hào)MF401519.1 的白黃小脆柄菇菌親緣關(guān)系最為相近，Bootstrap 支持率達(dá)到93%。因此將該菌株SHIHUX2 初步鑒定為白黃小脆柄菇。

2.3 液體發(fā)酵液酶活結(jié)果

測定初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵液的3 種木質(zhì)素降解酶 Mnp、Lip 和 Lac，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Mnp、Lip 的酶活為2.47×10-3U/mL，1.86×10-3U/mL，Lac 的酶活是 1.11 U/mL，與傅愷[22]的研究類似，白黃小脆柄菇的Mnp、Lip 產(chǎn)量較小，Lac 產(chǎn)量較大，所以將以Lac 為指標(biāo)優(yōu)化SHIHUX2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3，采用Design-Expert 8.05 軟件對表3中的Lac 產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，見表4。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experiment design and response values

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)顯著性方差分析Table 4 Analvsis of variance of the Plackett-Burman tests

由表4可知，在白黃小脆柄菇產(chǎn)Lac 的過程中，在a=0.10 的顯著水平上，蛋白胨、MgSO4和MnSO4對 Lac產(chǎn)量影響顯著。其中MgSO4和MnSO4的濃度對產(chǎn)Lac是正效應(yīng)，蛋白胨為負(fù)效應(yīng)，因此將KH2PO4、酒石酸銨和CuSO4取低水平，以蛋白胨、MgSO4和MnSO4作為主要因素進(jìn)一步做優(yōu)化試驗(yàn)。

2.5 爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 5 Steepest ascent path design and results

如表5所示，隨著蛋白胨、MgSO4和MnSO4濃度的變化，發(fā)酵液的Lac 酶活先升后降，當(dāng)?shù)鞍纂恕gSO4和 MnSO4濃度分別為 1.25、0.55 g/L 和 0.055 g/L 時(shí)，發(fā)酵液的Lac 酶活達(dá)到最大值，以此濃度作為中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.6.1 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果

以蛋白胨、MgSO4和MnSO43 個(gè)重要因素為自變量，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對產(chǎn)Lac 的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)了17 個(gè)試驗(yàn)組，各因素水平選擇以及結(jié)果見表6。

表6 BOX-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken tests

2.6.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert 8.05 軟件分析Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果，通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到自變量與粗纖維降解率（Y）對得到二次多項(xiàng)式方程：Y=2.21－0.032A＋0.14B＋0.16C－0.025AB＋0.040AC＋0.028BC－0.21A2－0.28B2－0.17C2，此模型的方差分析見表7。

表7 模型回歸方程方差分析Table 7 Analysis of variance of regression equations

2.6.3 響應(yīng)面分析

圖4～圖6是由響應(yīng)值和試驗(yàn)因素構(gòu)成間的三維響應(yīng)面圖，顯示了蛋白胨、MgSO4和MnSO4中任意1 個(gè)變量取零水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對漆酶活力的影響。

圖4 蛋白胨與MgSO4 對漆酶產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of peptone and MgSO4 on laccase production

由圖4可知，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍纂藶槟骋欢ㄖ禃r(shí)，隨著MgSO4的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，變化范圍較大，特別是在到達(dá)0 點(diǎn)之前上升趨勢明顯，超過0 點(diǎn)之后下降較緩；當(dāng)MgSO4濃度一定時(shí)，隨著蛋白胨的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，變化范圍較小，結(jié)合等高線的疏密程度，說明MgSO4比蛋白胨對漆酶活力的影響更顯著。

圖5 蛋白胨與MnSO4 對漆酶產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of peptone and MnSO4 on laccase production

由圖5可知，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍纂藶槟骋欢ㄖ禃r(shí)，隨著MnSO4的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，上升時(shí)坡度較大，下降時(shí)坡度較緩；當(dāng)MgSO4濃度一定時(shí)，隨著蛋白胨的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，變化范圍較小，結(jié)合等高線的疏密程度，說明MgSO4比蛋白胨對漆酶活力的影響更顯著。

圖6 MgSO4 與MnSO4 對漆酶產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of MgSO4 and MnSO4 on laccase production

由圖6可知，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)MgSO4為某一定值時(shí)，隨著MnSO4的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，且上升趨勢明顯；當(dāng)MnSO4濃度一定時(shí)，隨著MgSO4濃度的的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，變化的趨勢更緩慢，結(jié)合等高線的疏密度，說明MnSO4的主效應(yīng)大于MgSO4。

2.6.4 最佳培養(yǎng)基的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design-Expert 軟件對回歸方程求解得到模型最大值，即蛋白胨1.24 g/L，MgSO40.56 g/L，MnSO40.057 g/L，此時(shí)發(fā)酵液的漆酶活力最大值為2.27 U/mL。

在預(yù)測最佳培養(yǎng)基配方條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，做3 個(gè)重復(fù)，所得的實(shí)際發(fā)酵液漆酶活力為2.32 U/mL，與預(yù)測值2.27 U/mL 接近，說明該模型能較好的預(yù)測實(shí)際發(fā)酵情況。

3 結(jié)論與討論

采用苯胺藍(lán)-PDA 平板法和愈創(chuàng)木酚-PDA 平板法從從鐵皮石斛生長的樹皮中篩選到菌株SHIHUX2，經(jīng)ITS 測序分析將SHIHU-X2 鑒定為白黃小脆柄菇。采用Plackett-Burman 法從6 個(gè)因素中篩選對SHIHU-2 產(chǎn)漆酶影響最重要因素，結(jié)果表明，蛋白胨、MgSO4、MnSO4和對白黃小脆柄菇液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶活力影響較大。在此基礎(chǔ)上，用最陡爬坡試驗(yàn)及Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化，利用Design-Expert 軟件進(jìn)行二次回歸分析，得到各因素的最佳濃度為蛋白胨1.24 g/L，MgSO40.56 g/L，MnSO40.057 g/L，在此條件下實(shí)際發(fā)酵液漆酶活力可達(dá)到2.32 U/mL，所得值與模型預(yù)測值2.27 U/mL 相接近，較初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基的漆酶活力提高了109%。

傅愷[22]以去皮馬鈴薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO43 g/L 為培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)白黃小脆柄菇，其野生菌株培養(yǎng)至第6 天漆酶活力達(dá)高峰1.48 U/mL；經(jīng)紫外誘變選育到的漆酶高產(chǎn)誘變菌株U10-11 培養(yǎng)至第3 天時(shí)漆酶活力高峰4.63 U/mL。張麗等[23]以去皮馬鈴薯 300 g/L，葡萄糖 20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO43 g/L 為培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)白黃小脆柄菇，培養(yǎng)至第3天漆酶活力達(dá)高峰31 525 IU/L。白腐菌白黃小脆柄菇可以產(chǎn)生少量錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶，尤其是產(chǎn)漆酶潛力巨大，若通過基因工程等手段選育出漆酶高產(chǎn)的工程菌株，則有望應(yīng)用到漆酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。