吳昊 劉紅云 張莉 吳蕾 明文慶 蔡一杰

摘要 [目的]建立梯度洗脫HPLC法同時測定4種驅(qū)蟲類藥物的含量方法。[方法]采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫;流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長254 nm。通過液相保留時間、峰純度檢查和光譜相似度檢查。[結(jié)果]該色譜條件下阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑、地克珠利分離良好。阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑和地克珠利均在10～200 μg/mL線性良好，平均回收率分別為98.6%、99.5%、100.3%、99.1%，RSD分別為1.2%、1.0%、1.4%、0.8%。[結(jié)論]該研究開發(fā)的方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于同時測定以上4種驅(qū)蟲藥物的含量測定。

關(guān)鍵詞 阿苯達(dá)唑;三氯苯達(dá)唑;鹽酸左旋咪唑;地克珠利;含量測定;梯度洗脫HPLC法

中圖分類號 S859文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0210-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.062

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract [Objective]The research aimed to establish a method for simultaneous determination of four anthelmintic drugs by gradient elution HPLC.[Method]Analysis was performed on a C18 column （ 4.6 mm×250 mm，5 μm） with acetonitrile and 0.2% phosphoric acid solution as mobile phase under gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min in 30 ℃ condition.The determination wave length was 254 nm.Retention time，peak purity test and spectrum similar test were used.[Result]Under the chromatographic conditions，albendazole，triclabendazole，levamisole hydrochloride and diclazuril were well separated.Albendazole，triclabendazole，levamisole hydrochloride and diclazuril had good linearity at 10-200 μg/mL，the average recoveries were 98.6%，99.5%，100.3%，and 99.1%，respectively，and RSD were 1.2%，1.0%，1.4%，0.8%，respectively.[Conclusion]The method developed by the research is simple，accurate and reliable，and can be used for simultaneously determining the content of the above four anthelmintic drugs.

Key words Albendazole;Trichlorobenzole;Levamisole hydrochloride;Diclazuril;Content determination;Gradient elution HPLC

作者簡介 吳昊（1970—），男，安徽宿州人，高級獸醫(yī)師，碩士，從事獸藥、飼料、畜產(chǎn)品安全檢測工作。*通信作者，高級獸醫(yī)師，碩士，從事獸藥檢測技術(shù)研究。

收稿日期 2019-04-11

阿苯達(dá)唑是一種咪唑衍生物類廣譜驅(qū)腸蟲藥物，作為高效低毒的廣譜驅(qū)蟲藥，臨床可用于驅(qū)蛔蟲、蟯蟲、絳蟲、鞭蟲、鉤蟲、糞圓線蟲等。三氯苯達(dá)唑為新型咪唑類驅(qū)蟲藥，對各種日齡的肝片形吸蟲均有明顯驅(qū)殺效果，對牛、綿羊、山羊等反芻動物肝片吸蟲，牛大片形吸蟲、鹿肝片吸蟲、鹿大片形吸蟲、馬肝片吸蟲等均有效。鹽酸左旋咪唑為四咪唑的左旋體，且藥物對蟲體的微管結(jié)構(gòu)可能有抑制作用。鹽酸左旋咪唑還有免疫調(diào)節(jié)和免疫興奮功能，對蛔蟲、鉤蟲、蟯蟲和糞類圓線蟲病有較好療效。地克珠利屬三嗪苯乙腈化合物，為新型、高效、低毒抗球蟲藥，廣泛用于雞球蟲病[1-5]。

由于集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，由寄生蟲引起的畜禽疾病時常發(fā)生，不僅影響豬、羊、牛、雞等畜禽的健康成長，也影響?zhàn)B殖效益。為有效防治寄生蟲病，定期驅(qū)蟲、殺蟲便成了養(yǎng)殖者的重要管理工作之一。目前，阿苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑采用高氯酸滴定法，三氯苯達(dá)唑采用紫外分光光度法，地克珠利采用高效液相色譜法[6-10]。實驗室環(huán)境因素對高氯酸滴定結(jié)果影響較大，紫外分光光度法的定性效果不好。但對阿苯達(dá)唑等4種驅(qū)蟲類藥物的同時測定的研究鮮見報道。筆者對4種驅(qū)蟲類藥物的含量測定的液相方法進(jìn)行研究，并對該試驗方法進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。阿苯達(dá)唑片（規(guī)格0.1 g）、三氯苯達(dá)唑片（規(guī)格0.1 g）、鹽酸左旋咪唑片（規(guī)格50 mg）、地克珠利預(yù)混劑（規(guī)格0.5%），上述樣品均由安徽省某企業(yè)提供。

1.1.2 試劑。乙腈為色譜純，Merck KGaA公司;其余試劑均為分析純;試驗用水為milli-Q超純水。阿苯達(dá)唑?qū)φ掌?，來源于中國食品藥品檢定研究院，批號100373-201103，含量99.9%;三氯苯達(dá)唑?qū)φ掌?，來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號H0421108，含量99.8%;鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌?，來源于中國食品藥品檢定研究院，批號100167-201203，含量99.8%;地克珠利對照品，來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號H0131605，含量99.8%。

1.1.3 儀器。U3000戴安高效液相色譜儀，配戴安二極管陣列檢測器，美國熱電公司;BT-125D 電子天平，賽多利斯;KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件。色譜柱：Waters XSelect CSH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相A為乙腈，流動相B為0.2%磷酸溶液，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;掃描波長190～400 nm，記錄254 nm的色譜圖;進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 對照品儲備液的制備。精密稱取阿苯達(dá)唑?qū)φ掌?5 mg，置50 mL容量瓶中，加2 mL冰醋酸溶液溶解，用流動相定容至刻度，作為對照品儲備液;精密稱取三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌?0 mg，置50 mL容量瓶中，用流動相溶解定容至刻度，分別作為三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌穬湟?。精密稱取地克珠利對照品100 mg，置50 mL容量瓶中，用N-N二甲基甲酰胺溶解定容至刻度，作為地克珠利對照品儲備液。

1.2.3 混合對照品溶液及系統(tǒng)適應(yīng)性溶液的制備。分別精密量取阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑、地克珠利對照品儲備液各5 mL置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋定容至刻度，即得。

1.2.4 供試品溶液的制備。

1.2.4.1 阿苯達(dá)唑片供試品溶液的制備。取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于阿苯達(dá)唑25 mg），置 50 mL容量瓶中，加冰醋酸溶液10 mL，超聲使溶解，放冷，用流動相稀釋并定容至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得阿苯達(dá)唑片供試品溶液。

1.2.4.2 三氯苯達(dá)唑片供試品溶液的制備。取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于三氯苯達(dá)唑25 mg），置50 mL容量瓶中，用流動相溶解稀釋并定容至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL置 50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得三氯苯達(dá)唑片供試品溶液。

1.2.4.3 鹽酸左旋咪唑片供試品溶液的制備。取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于鹽酸左旋咪唑50 mg），置 50 mL容量瓶中，用流動相溶解稀釋并定容至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得鹽酸左旋咪唑片供試品溶液。

1.2.4.4 地克珠利預(yù)混劑供試品溶液的制備。取本品適量，精密稱定，加N-N二甲基甲酰胺溶解并定量稀釋成每1 mL中約含0.1 mg溶液，即得地克珠利預(yù)混劑供試品溶液。

1.2.5 方法學(xué)考察。

1.2.5.1 線性范圍。精密量取“1.2.2”的對照品儲備液適量，置于同一50 mL容量瓶中，用流動相配制含阿苯達(dá)唑質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/mL，三氯苯達(dá)唑質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/mL，鹽酸左旋咪唑質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/mL，地克珠利質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/mL。分別精密吸取上述系列溶液進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，測定峰面積;以對照品濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。

1.2.5.2 精密度試驗。精密吸取混合對照品溶液10 μL，按“1.2.1”色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計算RSD。

1.2.5.3 穩(wěn)定性試驗。取阿苯達(dá)唑片供試品溶液、三氯苯達(dá)唑片供試品溶液、鹽酸左旋咪唑片供試品溶液、地克珠利預(yù)混劑供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積，并計算RSD。

1.2.5.4 重復(fù)性試驗。取阿苯達(dá)唑片、三氯苯達(dá)唑片、鹽酸左旋咪唑片、地克珠利4種驅(qū)蟲類藥物，按照“1.2.4”方法制備供試品溶液各6份，按“1.2.1”色譜分析條件，進(jìn)樣量為10 μL，測定峰面積，計算RSD。

1.2.5.5 加樣回收率試驗。精密稱取已知含量的阿苯達(dá)唑片（規(guī)格0.1 g，含量為標(biāo)示量的105.4%）約相當(dāng)于阿苯達(dá)唑20 mg，共9份，置50 mL容量瓶中;精密稱取已知含量的三氯苯達(dá)唑片（規(guī)格0.1 g，含量為標(biāo)示量的100.4%）約相當(dāng)于三氯苯達(dá)唑20 mg，共9份，置50 mL容量瓶中;精密稱取已知含量的鹽酸左旋咪唑片（規(guī)格0.1 g，含量為標(biāo)示量的98.9%）約相當(dāng)于鹽酸左旋咪唑20 mg，共9份，置50 mL容量瓶中;精密稱取已知含量的地克珠利預(yù)混劑（規(guī)格0.5%，含量為標(biāo)示量的101.5%）約相當(dāng)于地克珠利80 mg，共9份，置50 mL容量瓶中。按高（120%）、中（100%）和低（80%）3個濃度水平分別添加阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑、地克珠利對照品，每個濃度水平的添加樣品分別制備3份，按照“1.2.4”方法制備供試品溶液，再按“1.2.1”色譜條件測定，進(jìn)樣量為10 μL，測定峰面積，計算平均回收率和RSD。

1.2.6 樣品含量測定。取阿苯達(dá)唑片、三氯苯達(dá)唑片、鹽酸左旋咪唑片、地克珠利預(yù)混劑各4批，一式2份，按“1.2.4”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，計算樣品中阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑、地克珠利的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗? 4種驅(qū)蟲類藥物在“1.2.1”色譜條件下完全分離，分離度均大于2.1，各化合物的色譜峰理論塔板數(shù)均大于7 000，方法專屬性良好。相應(yīng)對照品色譜圖、系統(tǒng)適應(yīng)性溶液色譜圖及空白試驗色譜圖見圖1～3。

2.2 線性范圍 按照“1.2.5.1”方法操作，從表2可以看出，阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑、地克珠利濃度均在10～200 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗 按照“1.2.5.2”方法操作，計算得出阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑、地克珠利的峰面積的RSD均為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗 按照“1.2.5.3”方法操作，計算得出阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑、地克珠利的峰面積的RSD分別為0.5%、0.3%、0.4%、0.3%，表明上述4種驅(qū)蟲類藥物的供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗 按照“1.2.5.4”方法操作，測得阿苯達(dá)唑的含量均值為標(biāo)示量的105.4%，RSD為0.6%（n=6）;三氯苯達(dá)唑的含量均值為標(biāo)示量的100.4%，RSD為0.7%（n=6）;鹽酸左旋咪唑的含量均值為占標(biāo)示量的98.9%，RSD為0.8%（n=6）;地克珠利的含量均值為標(biāo)示量的101.5%，RSD為0.3%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗 按照“1.2.5.5”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、吡喹酮、地克珠利平均回收率（n=9）分別為98.6%、99.5%、100.3%、99.1%，RSD分別為1.2%、1.0%、1.4%、0.8%，表明方法的準(zhǔn)確度較好。

3 討論與結(jié)論

分別考察了甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%磷酸水和乙腈-0.1%甲酸水4種流動相體系，結(jié)果表明，乙腈-0.2%磷酸水流動相體系分離效果最佳。因此該研究采用乙腈-0.2%磷酸水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，20%乙腈→80%乙腈;5～10 min，80%乙腈;10～15 min，80%乙腈→20%乙腈）。

在波長選擇上，采用DAD檢測器對阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑、地克珠利4種驅(qū)蟲類藥物進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示，在254 nm的波長下，這4種驅(qū)蟲類藥物均有良好的響應(yīng)值。因此采用254 nm作為該方法的檢測波長。

該研究建立的梯度洗脫同時測定阿苯達(dá)唑、三氯苯達(dá)唑、鹽酸左旋咪唑、地克珠利的含量的分析方法，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定性好、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，提高了工作效率，降低了試驗誤差。

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