于 軍,賀 丹,張 靈,李洪巖

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

病原微生物學(xué)是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中最重要的一門(mén)課程，也是比較特殊的一門(mén)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程。病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，也是當(dāng)今最受重視的一門(mén)教學(xué)。在醫(yī)學(xué)病原微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，尤其病原腸道致病菌：傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌的生化鑒定的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，衛(wèi)生部公布的《人間傳染的病原微生物名錄》，將傷寒桿菌、痢疾桿菌病原微生物列為第二類(lèi)病原微生物，屬高致病性病原微生物。根據(jù)《名錄的規(guī)定》，在實(shí)驗(yàn)室操作中，腸道致病菌等應(yīng)在BSL-2或在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[1-3]。

目前在國(guó)外世界衛(wèi)生組織(WHO為了指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室生物安全，減少實(shí)驗(yàn)室事故的發(fā)生，與1983年出版了《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》、各國(guó)各部門(mén)對(duì)生物安全要求都是硬性規(guī)定[4]。美國(guó)在1974年出版了《微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》首次提出了四級(jí)病原微生物危害和四級(jí)實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)的概念，主要涉及職業(yè)衛(wèi)生、生物安保、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、部分農(nóng)業(yè)病原體、生物毒素等新內(nèi)容[5]。

我國(guó)發(fā)布的《人間傳染的高致病性病原微生物實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)生物安全審批管理辦法》(衛(wèi)生部第50號(hào)令)中也強(qiáng)調(diào)：從事高致病性病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)資格必須經(jīng)過(guò)審批，三、四級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室從事高致病性病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，必須取得衛(wèi)生部頒發(fā)的《高致病性病原微生物實(shí)驗(yàn)室資格證書(shū)》[6-8]。

為了做好病原微生物學(xué)腸道桿菌的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，對(duì)病原微生物學(xué)腸道傷寒桿菌的減毒株的實(shí)驗(yàn)研究迫在眉睫。

項(xiàng)目起源于醫(yī)學(xué)病原微生物學(xué)臨床五年制教學(xué)大綱,項(xiàng)目名稱為病原性腸道桿菌的分離鑒定(712045).現(xiàn)改革其實(shí)驗(yàn)方法[9-12]。

1 材料與方法

1.1 傷寒桿菌臨床分離株、傷寒桿菌減毒株

傷寒桿菌臨床分離株(TH))由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系提供，(均為患者首次入院首次分離株)，傷寒桿菌減毒株(TY21a)、(PQ)由生物制品所提供。上述菌株經(jīng)法國(guó)梅里埃公司VITEK-32 微生物分析鑒定系統(tǒng)鑒定，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)控菌株： 大腸埃希菌JM101，為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

(1)培養(yǎng)基：S-S培養(yǎng)基(Salmonella-Shigella Agar；產(chǎn)品編號(hào)：HB4089;青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；克氏雙塘培養(yǎng)基(Kligler Iron Agar)：產(chǎn)品編號(hào)：HB6234;青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；半固體培養(yǎng)基(Semisolid Agar)；產(chǎn)品編號(hào)：HB4168-3;青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(LB Nutrient Agar,產(chǎn)品編號(hào)：HB0129;青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；LB肉湯培養(yǎng)基(LB Broth),產(chǎn)品編號(hào)：HB0128;青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；腸道編碼生化鑒定管：杭州天和公司。

(2)其他：瓊脂糖(上海生工生產(chǎn))；PEG 8000(Merck公司生產(chǎn))；

1.3 主要儀器和設(shè)備

臺(tái)式離心機(jī)(上海安享科學(xué)儀器廠)；電子天平(JD400-3型：沈陽(yáng)龍騰儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-240，上海智城分析儀器制造有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9162，中儀國(guó)科(北京)科技有限公司)；恒溫孵育搖床,ES-60杭州米歐儀器有限公司。

微波爐(WD800AS-4，格蘭仕公司生產(chǎn))；潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；透射電鏡(HITACHI H-7650：日本株式會(huì)社日立電器有限公司生產(chǎn))；醫(yī)用低溫冰箱(MDF-U300，日本松下公司)；生物顯微鏡(E100型，日本尼康公司)；制冰機(jī)(北京長(zhǎng)流科技有限公司生產(chǎn))。

2 方法

2.1 傷寒桿菌

傷寒減毒株的復(fù)蘇及培養(yǎng) (傷寒株—TH;傷寒減毒株：TY21a) 、(PQ)。

傷寒桿菌及傷寒減毒株接種LB肉湯培養(yǎng)基于恒溫震蕩搖床過(guò)夜培養(yǎng)，24 h后取出，于LB瓊脂平板上分離劃，培養(yǎng)8-12 h(37℃)。注意觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)完成后挑單菌落進(jìn)行接種，接種S-S培養(yǎng)基(Salmonella-Shigella Agar)，通常接種病原性腸道桿菌都選用鑒別培養(yǎng)基。因?yàn)镾-S培養(yǎng)基成分中含有乳糖、中性紅指示劑及抑制非腸道致病菌生長(zhǎng)的抑制劑。大腸埃希菌分解乳糖產(chǎn)酸，指示劑顯示成紅色。傷寒桿菌臨床分離株及傷寒減毒株不分解乳糖，生成透明菌落。有些腸道桿菌長(zhǎng)生硫化氫，故有黑色生成。

圖1 傷寒減毒株P(guān)Q及TY21a 的對(duì)比性培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

圖2 傷寒減毒株P(guān)Q及TY21a 與原傷寒臨床分離株TH

2.2 接種克氏雙糖培養(yǎng)基

傷寒桿菌及傷寒減毒株接種克氏雙糖培養(yǎng)基(Kligler Iron Agar)，37度24 h培養(yǎng)。圖2鐵雙塘培養(yǎng)基斜面含乳糖、產(chǎn)酸時(shí)候酚紅指示劑變黃，上層含有枸櫞酸銨鐵，故可看產(chǎn)生H2S,底部黑色及有無(wú)鞭毛。

2.3 傷寒桿菌及傷寒減毒株半固體培養(yǎng)基(Semisolid Agar)

用于觀察腸道菌的動(dòng)力培養(yǎng)基。

半固體培養(yǎng)基可以觀察動(dòng)力。產(chǎn)氣時(shí)培養(yǎng)基有氣泡或崩開(kāi)，可以觀察傷寒桿菌動(dòng)力。

表1 鐵雙塘培養(yǎng)傷寒桿菌及傷寒減毒株鑒定對(duì)比實(shí)驗(yàn)

2.4 腸道編碼生化鑒定

2.5 腸道因子血清學(xué)鑒定對(duì)比試驗(yàn)

沙門(mén)菌屬應(yīng)用已知的抗血清測(cè)定菌株的抗原成分，用已知的血清抗體與未知的腸道桿菌(抗原)進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，定屬、定群、定種。通過(guò)細(xì)菌的培養(yǎng)特性及生化反映可以初步鑒定病原性腸道桿菌，只有通過(guò)血清學(xué)鑒定才能最后確定檢測(cè)細(xì)菌的屬、群、種。

表2 傷寒桿菌及傷寒減毒株生化鑒定對(duì)比

+為產(chǎn)酸產(chǎn)氣注：糖發(fā)酵試驗(yàn)中，-為不發(fā)酵，+為產(chǎn)酸產(chǎn)氣

圖3 傷寒桿菌(TH)及傷寒減毒株(PQ)編碼鑒定對(duì)比

①沙門(mén)氏菌屬多價(jià)抗“O”血清

②沙門(mén)氏菌屬組抗“O”因子血清

③型抗“H”因子血清

方法：取一接種環(huán)診斷血清放于載玻片上，再?gòu)蔫F雙塘培養(yǎng)基上取少許培養(yǎng)物充分研磨混勻，同時(shí)生理鹽水作對(duì)照。

結(jié)果：對(duì)照均勻渾濁。培養(yǎng)物與診斷血清室溫?cái)?shù)分鐘后肉眼可見(jiàn)顆粒狀凝集，為陽(yáng)性。經(jīng)過(guò)對(duì)比，傷寒桿菌及傷寒減毒株皆為陽(yáng)性。

圖4 大腸埃希菌及編碼鑒定對(duì)照

圖5 傷寒桿菌(TH)及減毒株(TY21a)因子血清學(xué)鑒定

3 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：S-S培養(yǎng)基傷寒桿菌及傷寒減毒株均生長(zhǎng)，革蘭染色為革蘭陰性菌；鐵雙塘培養(yǎng)基均生長(zhǎng)傷寒桿菌及傷寒減毒株；有H2S產(chǎn)生、有動(dòng)力。血清學(xué)鑒定：診斷血清室溫?cái)?shù)分鐘后肉眼可見(jiàn)顆粒狀凝集，傷寒桿菌及傷寒減毒株皆為陽(yáng)性。由此得出結(jié)論：醫(yī)學(xué)生病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課中腸道致病性桿菌的傷寒桿菌，可以用傷寒減毒株(Ty21a)或(PQ)取代[10，11]。這樣既可以保持病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課學(xué)生的生物安全，醫(yī)學(xué)生可以學(xué)習(xí)到腸道致病菌的一系列生化特性，掌握全面的致病性腸道桿菌的生物學(xué)特性，又可以避免臨床分離株對(duì)師生造成感染。達(dá)到了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的安全性、系統(tǒng)性、完整性[12，13]。