陶雪梅, 朱紅霞, 高立紅, 李仁勇

(1. 甘肅省環(huán)境監(jiān)測中心, 甘肅 蘭州 730030; 2. 中國環(huán)境監(jiān)測總站, 北京 100012; 3. 賽默飛世爾科技 (中國)有限公司應(yīng)用研發(fā)中心, 北京 100085; 4. 中科譜研(北京)科技有限公司, 北京 100027)

草甘膦(glyphosate, GLY, C3H8NO5P)和草銨膦(glufosinate, GLUF, C5H15N2O4P)都是常用廣譜除草劑;氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid, AMPA, CH6NO3P)是草甘膦的主要降解產(chǎn)物。草甘膦屬滅生性除草劑,草銨膦屬觸殺性除草劑。草甘膦因高效、低價(jià)、人體代謝快等優(yōu)勢使用量大、應(yīng)用廣泛[1],而草銨膦則是以其除草迅速、可去除多年生惡性雜草的優(yōu)勢,作為新一代除草劑進(jìn)入市場[2]。隨著這兩種除草劑使用量日益增大,其在土壤中的殘留問題越來越受到關(guān)注。目前已有多項(xiàng)研究表明,草甘膦和草銨膦具有毒性作用,對土壤生態(tài)環(huán)境和人體健康都具有潛在危害[3-11]。Marlise等[12]研究了草甘膦對新生大鼠子宮形態(tài)以及細(xì)胞分化增殖蛋白表達(dá)的影響,認(rèn)為草甘膦有引起女性生育能力下降并致子宮瘤的可能。

目前測定土壤中草甘膦、氨甲基膦酸和草銨膦殘留量的方法主要有氣相色譜法[13,14]、液相色譜法[15-18]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-25]和離子色譜法[26-28]。由于3種目標(biāo)物的水溶性強(qiáng)且沒有紫外吸收,用氣相色譜和液相色譜檢測都需繁瑣的衍生過程。液相色譜-質(zhì)譜法則因其公認(rèn)的操作繁瑣而應(yīng)用并不普遍。故而離子色譜法有一定的優(yōu)勢。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[26-28]中使用離子色譜法測定3種目標(biāo)物時(shí),使用的檢測器均為電導(dǎo)檢測器,目前暫無離子色譜-安培檢測法同時(shí)測定3種農(nóng)藥的文獻(xiàn)報(bào)道。常見陰離子在電導(dǎo)檢測時(shí)有響應(yīng),基質(zhì)干擾大,導(dǎo)致目標(biāo)物檢測的靈敏度低、檢出限高。而在安培檢測器上,常見陰離子無響應(yīng),這使該方法在選擇性和靈敏度方面優(yōu)勢明顯。本研究選用2 mmol/L氫氧化鈉振蕩提取,IC-C18和IC-Na柱固相萃取凈化,采用離子色譜-安培檢測法同時(shí)測定農(nóng)田土中草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸。前處理操作簡單快速,回收率高,定性定量準(zhǔn)確,分析速度快,能滿足實(shí)際工作的需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ICS5000+離子色譜儀,配脈沖安培檢測器(美國Thermo Fisher公司); 0.1 mg和0.01 mg分析天平(瑞士梅特勒公司); Milli-Q超純水儀(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司);小型振蕩器(北京國環(huán)高科自動(dòng)化技術(shù)研究院);水系針式過濾器(0.22 μm,杉羽天津科技發(fā)展有限公司); IC-C18柱和IC-Na柱(中國Agela公司); 50%氫氧化鈉水溶液(英國AlafAesar公司);氨甲基膦酸(純度≥99.9%)和草甘膦(純度≥98.6%)(德國Dr. Ehrenstorfer公司),草銨膦(上海Aladdin industrial Corporation公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1儀器條件

離子色譜條件:IonPacAS11-HC色譜柱(250 mm×4 mm);流速0.5 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量200 μL;淋洗液為100 mmol/L氫氧化鈉和純水,梯度條件見表1;柱后加堿淋洗液及流速為100 mmol/L氫氧化鈉,0.2 mL/min。

表 1 NaOH梯度淋洗程序Table 1 Gradient of NaOH elution procedure

A: H2O; B: 100 mmol/L NaOH.

1.2.2樣品前處理

提取:參照HJ/T 166土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范,將土樣風(fēng)干后過60目篩。稱取2.5 g試樣(精確至0.001 g)于50 mL具塞聚乙烯管中,加入50 mL 2 mmol/L氫氧化鈉溶液,300 r/min下振蕩1 min。

凈化:將提取液依次用0.22 μm水系針式濾器、IC-C18和IC-Na柱凈化,棄去2 mL初流出液后開始收集,待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子色譜柱的選擇

選用實(shí)驗(yàn)室常用的4種陰離子色譜柱,研究它們對3種目標(biāo)物的分離效果:IonpacAS20(250 mm×2 mm)、IonpacAS23(250 mm×4 mm)、IonpacAS19(250 mm×4 mm)和IonpacAS11-HC(250 mm×4 mm)。結(jié)果表明:草銨膦和氨甲基膦酸在IonpacAS20柱上不能完全分離;目標(biāo)物在IonpacAS23柱和IonpacAS19柱上的響應(yīng)較低;目標(biāo)物在IonpacAS11-HC柱上的響應(yīng)高,且草銨膦和氨甲基膦酸分離較好。故最終選用IonpacAS11-HC色譜柱(250 mm×4 mm)。色譜柱型號不同,填料的粒徑、鍵合功能基和數(shù)量、親水性能等均有一定差異,因此會出現(xiàn)有些色譜柱響應(yīng)低且不能有效分離的現(xiàn)象。

2.2 檢測器的選擇

圖 1 加標(biāo)土壤樣品的色譜圖(電導(dǎo)檢測器)Fig. 1 Chromatogram of a spiked soil sample(conductivity detector) Spiked levels: GLUF, 1.00 mg/L; AMPA, 1.00 mg/L; GLY, 1.00 mg/L.

2.3 離子色譜條件的優(yōu)化

IonpacAS11-HC色譜柱(250 mm×4 mm)在流速為1.0 mL/min時(shí)柱效最高。但如圖2所示,在此流速下,草銨膦和氨甲基膦酸的色譜峰分離度R<1.5;在0.5 mL/min的流速條件下,草銨膦和氨甲基膦酸可以有效分離。故選用0.5 mL/min的淋洗液流速。

圖 2 淋洗液流速對加標(biāo)土壤樣品分離的影響Fig. 2 Effect of the eluent flow rate on the separation of the spiked soil sample Spiked levels: 0.10 mg/L.

草銨膦和氨甲基膦酸在IonpacAS11-HC上的保留較弱,而草甘膦在IonpacAS11-HC上的保留較強(qiáng)。且在一定濃度范圍內(nèi),隨著淋洗液的濃度升高,3種目標(biāo)物的峰面積變大。但當(dāng)淋洗液濃度大于30 mmol/L時(shí),草銨膦和氨甲基膦酸不能完全分離。為解決該問題,選用梯度淋洗和柱后加堿的方法[29-31],在色譜柱后、檢測器前增加一路低流速、高濃度的淋洗液,提高目標(biāo)物測定的靈敏度。如圖3所示,柱后加堿可使草甘膦的檢查靈敏度明顯提高。

圖 3 柱后加堿對標(biāo)準(zhǔn)溶液分離的影響Fig. 3 Effect of the post-column addition of alkali on the separation of the standard solution Mass concentrations: 0.50 mg/L.

按照優(yōu)化的色譜條件(見1.2.1節(jié)),所得加標(biāo)實(shí)際樣品的色譜圖見圖4。

2.4 提取劑的選擇

應(yīng)用離子色譜法測定3種目標(biāo)物時(shí),常用的提取液為純水和堿溶液[19-21]。提取液濃度對不同目標(biāo)物提取效率的影響程度不同。如圖5所示,隨著氫氧化鈉濃度的升高,草銨膦和草甘膦的加標(biāo)回收率逐漸降低;而氨甲基膦酸的加標(biāo)回收率逐漸升高,在10 mmol/L時(shí)達(dá)到最大回收率102.4%。為實(shí)現(xiàn)3種目標(biāo)物同時(shí)測定,且盡量少引入干擾,最終選用2 mmol/L氫氧化鈉作為提取劑。

圖 4 加標(biāo)土壤樣品的色譜圖(安培檢測器)Fig. 4 Chromatogram of a spiked soil sample(amperometric detector)Spiked levels: GLUF, 1.00 mg/L; AMPA, 0.20 mg/L; GLY, 1.00 mg/L.

圖 5 氫氧化鈉提取液濃度對加標(biāo)回收率的影響Fig. 5 Effect of the concentration of sodium hydroxide on the spiked recovery

圖 6 超聲提取和振蕩提取對目標(biāo)物測定的影響Fig. 6 Effect of the ultrasonic extraction and the shaking extraction on the determination of the targets

2.5 提取方式的選擇

對比超聲提取和機(jī)械振蕩提取兩種提取方式,結(jié)果如圖6所示。超聲提取后,提取液中雜質(zhì)峰較大,影響目標(biāo)物(尤其是草銨膦)的測定。原因可能是,超聲提取時(shí),樣品溫度升高,干擾物的提取量增加,而干擾物的保留時(shí)間與草銨膦接近,影響了定量。振蕩提取時(shí),3種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率滿足要求。

2.6 老化時(shí)間的影響

測定土壤樣品的加標(biāo)回收率,不可避免地要討論標(biāo)準(zhǔn)溶液滴入土壤中的老化時(shí)間,以保證加標(biāo)樣在實(shí)際土壤上的吸附平衡。在2.5 g土壤樣上滴加50 μL 250 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,放置不同時(shí)間后測定,結(jié)果如圖7所示?？梢姺胖脮r(shí)間對氨甲基膦酸的影響不大;而草銨膦和草甘膦的加標(biāo)回收率在放置5 h后低于70%,且在5 h時(shí)滴入的50 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液已干。因此,為保證加標(biāo)回收率滿足要求且標(biāo)準(zhǔn)溶液在土壤中吸附平衡,滴加并放置5 h后進(jìn)行樣品提取。

圖 7 老化時(shí)間對加標(biāo)回收率的影響Fig. 7 Effect of the aging time on the spiked recovery

圖 8 振蕩時(shí)間對加標(biāo)回收率的影響Fig. 8 Effect of the oscillation time on the spiked recovery

2.7 振蕩時(shí)間的選擇

在300 r/min的條件下,在1～15 min內(nèi)記錄目標(biāo)物的加標(biāo)回收率,結(jié)果如圖8所示。3種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率在不同振蕩時(shí)間下變化不大。為提高萃取效率,且考慮方法的普適性,最終選取振蕩時(shí)間為5 min。

2.8 提取劑體積的選擇

通過改變提取劑和土壤質(zhì)量比的方式選擇最佳的提取液體積。如圖9所示,除5∶1和50∶1時(shí)有回收率低于80%的現(xiàn)象外,其他情況下的回收率均在80%～102%之間。為防止樣品過度稀釋造成靈敏度降低,同時(shí)也為滿足樣品的測定體積,最終選擇提取液和土壤樣品質(zhì)量比為20∶1,即1 g土壤用20 mL 2 mmol/L NaOH振蕩提取。

圖 9 提取劑和土壤的質(zhì)量比對加標(biāo)回收率的影響Fig. 9 Effect of the mass ratio of the extractant and the soil sample on the spiked recovery

2.9 凈化條件的優(yōu)化

土壤中含有大量可溶于水的有機(jī)物和無機(jī)物。由于進(jìn)樣量較大,大量樣品測試時(shí)會降低色譜柱的使用壽命。為了去除提取液中的干擾雜質(zhì),選用IC 柱凈化,其中IC-C18柱去除樣品基質(zhì)中的疏水性物質(zhì),IC-Na柱去除提取液中的重金屬。為保證處理過程對目標(biāo)物的測定不產(chǎn)生影響,標(biāo)準(zhǔn)溶液先用不同IC柱凈化,所得色譜圖如圖10。目標(biāo)物的色譜峰重疊性較好,可見IC柱對目標(biāo)物的測定影響不大,可以用于提取液的凈化。

圖 10 加標(biāo)樣品經(jīng)不同IC柱凈化后的色譜圖Fig. 10 Chromatograms of the spiked sample purified by different IC columns Spiked levels: GLUF, 0.25 mg/L; AMPA, 0.05 mg/L; GLY, 0.25 mg/L.

2.10 檢出限和線性方程

按照HJ 168-2010中的檢出限計(jì)算公式,對低濃度的目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定7次,結(jié)果見表2。草銨膦、氨甲基膦酸和草甘膦的方法檢出限分別為0.08、0.02和0.04 mg/kg,滿足土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB 15618-2008征求意見稿)中土壤有機(jī)物的第二級標(biāo)準(zhǔn)對草甘膦(0.5 mg/kg)的限值要求。

表 2 草銨膦、氨甲基膦酸和草甘膦的方法檢出限(n=7)Table 2 LODs of GLUF, AMPA, and GLY (n=7)

表 3 GLUF、AMPA和GLY的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Regression equations and correlation coefficients (r2) for GLUF, AMPA and GLY

y: peak area;x: mass concentration of the analyte, mg/L.

用優(yōu)化后的測定條件對3種目標(biāo)物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,其中草銨膦和草甘膦的線性范圍是20.0～1 000 μg/L,氨甲基膦酸的線性范圍是5.0～400 μg/L。以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制校準(zhǔn)曲線,得出回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)(r2),具體如表3所示。

2.11 實(shí)際樣品測試

采集北京某地農(nóng)田土,按照優(yōu)化后的測定條件對樣品中的3種目標(biāo)物進(jìn)行測定。3種目標(biāo)物中只有氨甲基膦酸有檢出,說明該農(nóng)田噴灑過除草劑草甘膦,且已經(jīng)降解成氨甲基膦酸。平行測定6次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～5.0%,加標(biāo)回收率為80.2%～106%(見表4)。

表 4 3種目標(biāo)物在農(nóng)田土中3個(gè)水平下的加標(biāo)回收率(n=6)Table 4 Recoveries of the three targets at three spiked levels in farmland soil (n=6)

ND: not detected.

3 結(jié)論

本文建立了一種簡單、快捷、同時(shí)測定農(nóng)田土中草銨膦、氨甲基膦酸和草甘膦殘留量的高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測方法。樣品采用2 mmol/L氫氧化鈉溶液提取和IC-C18和IC-Na柱快速凈化的方法進(jìn)行樣品前處理,IonpacAS11-HC離子色譜柱分離,安培檢測器檢測。實(shí)際樣品分析表明本方法抗干擾性強(qiáng),靈敏度和準(zhǔn)確度高,操作簡便快捷,適用于農(nóng)田土壤中草銨膦、氨甲基膦酸和草甘膦殘留的同時(shí)快速定量分析。