聶雪梅, 董旭陽(yáng),2, 許秀麗, 張 峰*

(1. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 北京,100176; 2. 陜西科技大學(xué), 西安,710021)

β-受體阻滯劑(β-blockers, BBS)可選擇性地與β腎上腺素受體結(jié)合,拮抗兒茶酚胺和神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)β受體的激動(dòng)作用,在治療心血管和心功能不全等疾病中有非常重要的作用[1],但β-受體阻滯劑的不當(dāng)使用會(huì)導(dǎo)致心肌耗氧量和血管阻力增加,氧自由基和心肌細(xì)胞凋亡[2,3]。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中,β-受體阻滯劑常被非法添加在飼料中,通過降低動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)量來提高飼料轉(zhuǎn)化率;在動(dòng)物屠宰或運(yùn)輸前數(shù)小時(shí)也會(huì)被非法注射到動(dòng)物體內(nèi)來緩解應(yīng)激反應(yīng),降低動(dòng)物在運(yùn)輸壓力下的發(fā)病率和死亡率[4,5]。另外β-受體阻滯劑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)進(jìn)一步發(fā)生代謝,生成藥理活性更高的代謝物[6]。如卡維地洛的代謝物4-羥基苯基卡維地洛,其腎上腺素受體阻滯效能比原藥高約13倍,而該類藥物及其代謝物在動(dòng)物體內(nèi)殘留風(fēng)險(xiǎn)較高,可引起人類急性中毒的癥狀[7]。為滿足監(jiān)管的要求,建立一種快速篩查β-受體阻滯劑及其代謝物殘留的分析方法是非常必要的。

目前,世界上一些地區(qū)和組織已經(jīng)為動(dòng)物源性食品中卡拉洛爾設(shè)定了最大殘留限量,以保護(hù)公眾健康。歐盟和國(guó)際食品法典委員會(huì)規(guī)定了食用動(dòng)物組織中卡拉唑醇的最大殘留限量,豬腎中為25 μg/kg,牛腎中為15 μg/kg[8]。但對(duì)于β-受體阻滯劑的代謝物(如4-羥基苯基卡維地洛等),尚未設(shè)定殘留限量。我國(guó)目前既未批準(zhǔn)BBS作為獸藥使用,也未明確BBS及其代謝物的相關(guān)限量要求。因此,建立動(dòng)物源食品中β-受體阻滯劑及其代謝物的高通量篩查分析方法具有重大意義。

為了監(jiān)控β-受體阻滯劑的非法使用,全世界的監(jiān)管機(jī)構(gòu)正在測(cè)試動(dòng)物源性食品中的此類藥物。常用的分析方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、液相色譜法(LC)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、液相色譜-熒光檢測(cè)法(LC/UV)、氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)[9,10]等。其中ELISA定量不準(zhǔn)確且操作程序復(fù)雜,檢測(cè)后需要其他方法驗(yàn)證。液相色譜法和液相色譜-熒光檢測(cè)法的靈敏度較低,無法滿足對(duì)痕量化合物的分析要求。氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法具有較好的靈敏度,但前處理需衍生化,費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)并增加了樣品污染的可能性。液相色譜-質(zhì)譜法作為目前應(yīng)用較多的方法,可以進(jìn)行多殘留定性、定量檢測(cè),方便快速[11,12]。近年來,超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap MS)在動(dòng)物源性食品中的農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域逐漸普及,但對(duì)于肉類食品中β-受體阻滯劑及其代謝物殘留分析的篩查分析方法的相關(guān)研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用Q-Orbitrap高分辨質(zhì)譜分析系統(tǒng),建立了同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源食品中20種β-受體阻滯劑類藥物及代謝產(chǎn)物的分析方法。該方法簡(jiǎn)單,快速,靈敏度高,為動(dòng)物源性食品的安全提供了保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

乙酸銨、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(分析純,北京化工廠);甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)Thermo Fisher公司);甲酸(純度>99%,北京百靈威科技有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:卡拉洛爾、馬來酸噻嗎洛爾、納多洛爾、吲哚洛爾、美托洛爾(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司);醋丁洛爾、卡維地洛、噴布洛爾、普萘洛爾、鹽酸倍他洛爾、阿普洛爾、氧烯洛爾、塞利洛爾、富馬酸比索洛爾(法國(guó)EP公司)鹽酸拉貝洛爾純度(美國(guó)U.S.P公司);二醋洛爾、氯拉洛爾、艾司洛爾、7-羥基普萘洛爾、羥基噻嗎洛爾、羥苯基卡維地洛、羥基阿替洛爾(加拿大Toronto Research Chemicals公司);以上試劑純度均大于96%。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-Exactive超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher公司); Milli-R04純水儀(德國(guó)Millipore公司); Allegra X-22R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司); ML104/02分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司); VORTEX GENIUS3渦旋混合器(德國(guó)IKA公司);全溫振蕩培養(yǎng)器(德國(guó)Sartorius公司)。

1.3 溶液的配制

準(zhǔn)確稱取20種β-受體阻滯劑及其代謝物各1 mg(精確至0.000 1 g),分別置于20 mL的棕色小瓶中,各加入5.00 mL的甲醇,振蕩搖勻,待固體完全溶解后,再加入5.00 mL的甲醇,配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,在-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。分別精密移取上述20種β-受體阻滯劑及代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.50 mL至10 mL棕色小瓶中,混勻,配制成5 mg/L的β-受體阻滯劑及代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,并放置于-20 ℃冰箱中保存待用。

稱取15.400 0 g乙酸銨,溶于水中,用乙酸調(diào)pH值為5.2。充分搖勻后,加入37.5 g乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉并定容至1.0 L,配制成EDTA提取液并放置于4 ℃冰箱中保存待用。

1.4 樣品前處理

將肉類樣品攪碎后,稱取1.000 0 g樣品到50 mL聚丙烯離心管中,加入5.00 mL乙二胺四乙酸提取液和20.0 μLβ-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶后,在旋轉(zhuǎn)器上混合1 min, 50 ℃下全溫振蕩培養(yǎng)器中300 r/min振蕩酶解2 h。待其冷卻至室溫后,用3.0 mol/L氫氧化鈉溶液pH調(diào)節(jié)至10。將乙腈(20.00 mL)、氯化鈉(2.000 0 g)依次加入到樣品中,搖勻振蕩提取30 min后在4 ℃下以10 000 r/min離心15 min。取上清液過0.22 μm尼龍膜到進(jìn)樣小瓶中,上機(jī)檢測(cè)。

1.5 儀器條件

1.5.1色譜條件

色譜柱:ALORICH Ascentis?C8(10 cm×4.6 mm, 3 μm)。流動(dòng)相:0.1%(v/v)的甲酸水溶液(A)、乙腈(B)。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 5%B; 0.5～9.0 min, 5%B～95%B; 9.0～12.5 min, 95%B; 12.5～14.0 min, 95%B～5%B; 14.0～15.0 min, 5%B。柱溫箱溫度為30 ℃,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣體積為5 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件

Q-Orbitrap HRMS配備了加熱電噴霧電離源(HESI),掃描模式為正離子掃描,數(shù)據(jù)依賴模式(Full MS/dd-MS2),質(zhì)量掃描范圍m/z100～500。一級(jí)分辨率70 000,二級(jí)分辨率35 000。歸一化碰撞能量(normalized collision energies, NCE)設(shè)定為15%、25%和35%,噴霧電壓設(shè)定為3.0 kV,毛細(xì)管溫度和輔助氣體加熱器溫度均為350 ℃。20種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)

在樣品中,除分析物以外的組分都被稱為基質(zhì)。基質(zhì)中存在的干擾物會(huì)與目標(biāo)物共洗脫,改變待測(cè)組分的離子化效率,降低方法的靈敏度,影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[13,14]?；|(zhì)效應(yīng)(ME)根據(jù)相同濃度的分析物在純有機(jī)溶液中與在空白基質(zhì)溶液中的響應(yīng)比值來評(píng)估[15]:

ME=B/A×100%

(1)

其中A為純?nèi)軇┲写郎y(cè)物的響應(yīng)值,B為樣品基質(zhì)中添加的相同含量待測(cè)物的響應(yīng)值。動(dòng)物源性食品成分復(fù)雜,基質(zhì)效應(yīng)明顯。為了最大限度地消除基質(zhì)效應(yīng),本實(shí)驗(yàn)在空白基質(zhì)中加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液建立校正曲線。這樣標(biāo)準(zhǔn)空白基質(zhì)和待測(cè)化合物具有相同的離子化環(huán)境,從而有效消除基質(zhì)效應(yīng)。

表 1 20種目標(biāo)化合物的色譜-質(zhì)譜參數(shù)Table 1 LC-MS parameters of the 20 target compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

在對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測(cè)時(shí),應(yīng)最大程度考慮色譜峰峰形的對(duì)稱性,以確保開發(fā)的檢測(cè)方法以峰面積對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量時(shí),有更加接近真值的結(jié)果[16]。因此,色譜柱與流動(dòng)相的選擇非常關(guān)鍵。

圖 1 3種色譜柱對(duì)卡拉洛爾的分離效果Fig. 1 Separation of carazolol on the three chromatographic columnsa. ALORICH Ascentis? C8 (10 cm×4.6 mm, 3 μm); b. Waters ACQUITY UPLC? BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); c. Waters BEH HILIC (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm).

本實(shí)驗(yàn)考察了Waters ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters BEH HILIC (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和ALORICH Ascentis?C8(10 cm×4.6 mm, 3 μm)這3種色譜柱對(duì)目標(biāo)物的分離效果。色譜柱優(yōu)化時(shí),流動(dòng)相采用實(shí)驗(yàn)室常用流動(dòng)相(甲醇和0.1%(v/v)甲酸水溶液)。以卡拉洛爾為例,3種色譜柱的分離效果如圖1所示。觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),HILIC色譜柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離時(shí),色譜峰分叉嚴(yán)重,這可能是由于β-受體阻滯劑類藥物極性范圍較寬,而適用于極性化合物的HILIC色譜柱對(duì)β-受體阻滯劑類化合物的分離效果不夠理想。C18色譜柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離時(shí),峰形較差,這對(duì)目標(biāo)物定性及定量結(jié)果有很大的影響。而C8色譜柱得到的色譜峰峰形良好,適合用于β-受體阻滯劑類藥物的分離。該色譜柱填料為高純硅膠,與普通C18色譜柱相比,具有更好的親水性,對(duì)于β-受體阻滯劑色譜峰峰形的改善、峰寬減小等有很大幫助。

除色譜柱外,流動(dòng)相的選擇對(duì)待測(cè)物的分離及質(zhì)譜的檢測(cè)結(jié)果也有很大的影響。色譜柱選定后,通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇、乙腈與0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物的分離情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,乙腈作為有機(jī)相時(shí)目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度較甲醇高。由于本實(shí)驗(yàn)采用正離子模式檢測(cè),因此在水相中加入少量酸可增強(qiáng)目標(biāo)物的響應(yīng)。對(duì)比發(fā)現(xiàn),乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液作流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物的色譜峰峰形好,響應(yīng)高。在優(yōu)化的儀器條件下,20種β-受體阻滯劑類藥物及其代謝物的色譜圖見圖3。

圖 2 不同流動(dòng)相對(duì)卡拉洛爾的分離效果Fig. 2 Separation effect of different mobile phases on carazolol a. methanol-0.1% (v/v) formic acid; b. acetonitrile-0.1% (v/v) formic acid.

圖 3 20種β-受體阻滯劑及代謝物的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the 20 β-blockers and metabolites

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜,并且本實(shí)驗(yàn)要同時(shí)檢測(cè)20種β-受體阻滯劑及代謝物。因此,在前處理過程中進(jìn)行凈化方法的選擇時(shí),在保證目標(biāo)化合物物回收率良好的前提下,需要最大程度除去雜質(zhì),以提高目標(biāo)物的靈敏度。

2.2.1QuEChERS凈化

移取振蕩提取后的樣品上清液4 mL到10 mL離心管中,加入0.9 g無水硫酸鎂、150 mg C18和150 mg乙二胺-N-丙基硅烷,振蕩2 min后靜置,取上清液過0.22 μm濾膜。上機(jī)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),加標(biāo)樣品中卡拉洛爾、氧烯洛爾、普萘洛爾、阿普洛爾、比索洛爾、噻嗎洛爾等10種目標(biāo)化合物的回收率均小于60%。

表 2 20種目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r2), linear ranges, LODs and LOQs of the 20 target compounds

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.2.2固相萃取

將振蕩提取后的樣品靜置分層后,移取2 mL上清液分別過親水親脂分配固相萃取柱(Waters Oasis HLB, 200 mg/6 mL)和混合強(qiáng)陽(yáng)離子固相萃取柱(Waters Oasis MCX, 150 mg/6 mL)。HLB柱用甲醇-水(5∶95, v/v)和甲醇-乙腈(1∶9, v/v)依次淋洗。MCX柱用含有5%(v/v)氨水的甲醇淋洗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用MCX柱進(jìn)行凈化時(shí),目標(biāo)物的回收率更高。這是由于HLB柱是共價(jià)鍵結(jié)合分配機(jī)理,因此目標(biāo)物回收率不夠理想。而MCX柱的原理為苯磺酸型強(qiáng)陽(yáng)離子交換機(jī)理,是將磺酸基鍵合在高度交聯(lián)的聚(苯乙烯-二乙烯基苯) (PS/DVB)表面,具有反相和交換雙重保留性能,對(duì)堿性化合物有良好的保留性能[17,18]。但還是有少量化合物的回收效果不佳。

2.2.3高速低溫離心

將振蕩提取后的樣品于4 ℃下10 000 r/min離心15 min。取上清液過0.22 μm濾膜進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),20種目標(biāo)化合物的平均回收率在60.37%～100.84%,回收率良好。這可能是由于該方法減少了凈化步驟,避免了目標(biāo)化合物在凈化過程中的損失。除此之外,該方法操作簡(jiǎn)單,試劑使用量少。因此,本研究采用該方法對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍和檢出限

分別添加0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/L的目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)到空白基質(zhì)溶液中。以20種目標(biāo)化合物的響應(yīng)峰面積-對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制工作曲線。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,20種化合物在0.1～10 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。在空白樣品中分別添加一系列濃度的目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行前處理和測(cè)定,以3倍信噪比確定檢出限(LOD),以10倍信噪比確定定量限(LOQ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,20種目標(biāo)化合物的檢出限為1～5 μg/kg,定量限為2～10 μg/kg。具體結(jié)果見表2。

2.3.2回收率與精密度

空白樣品中添加低、中、高3個(gè)水平的20種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)水平進(jìn)行6次試驗(yàn)。結(jié)果表明,20種化合物的平均回收率為60.37%～100.84%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%(見表3)。其準(zhǔn)確度與精密度能滿足殘留檢測(cè)的要求,表明該分析方法可靠、準(zhǔn)確,適合此類物質(zhì)的定量分析。

2.4 實(shí)際樣品的分析

購(gòu)買來自不同國(guó)家和地區(qū)的市售豬肉共20份,將本實(shí)驗(yàn)建立的方法應(yīng)用到20份樣品中β-受體阻滯劑及代謝物殘留的檢測(cè)中。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)際樣品中均未檢出該類物質(zhì),未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。

表 3 20種目標(biāo)化合物在3個(gè)添加水平下的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of the 20 target compounds at three spiked levels (n=6)

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜快速篩查方法,實(shí)現(xiàn)了20種β-受體阻滯劑及代謝物的定性、定量分析。該法操作簡(jiǎn)單,重現(xiàn)性好,分辨率高,能同時(shí)對(duì)動(dòng)物源性食品中20種β-受體阻滯劑及代謝物殘留進(jìn)行篩查定量。