曹梅榮, 馬俊美, 王 娟, 翟洪穩(wěn), 趙曉雅, 范素芳

(河北省食品檢驗研究院, 河北省食品安全重點實驗室, 河北 石家莊 050091)

隨著消費者對于綠色功效性化妝品的推崇,化妝品研發(fā)人員越來越多的從天然植物中尋找原料。目前,部分植物提取物中的功能性成分在改善皮膚外觀、調(diào)理皮膚狀態(tài)、養(yǎng)發(fā)護發(fā)等方面具有顯著作用,已被廣泛應用于各類化妝品中[1,2]。然而,我們在利用天然植物的有效成分時,必須去除與功能成分并存的有毒活性物物質(zhì)。例如，烏頭中的烏頭堿(aconitine)、次烏頭堿(hypaconitine)和新烏頭堿(mesaconitine)等二萜類型生物堿能麻痹感覺神經(jīng)和中樞神經(jīng),毒害心肌細胞,導致心臟中毒而危害生命[3]。茄科植物中的阿托品(atropine)和東莨菪堿(scopolamine),屬于莨菪烷型生物堿,具有散瞳、抑制腺體分泌和大腦皮質(zhì)的作用[4]；馬錢子中主要的有毒成分為番木鱉堿(brucine)和士的寧(strychnine),會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響,甚至造成腎臟和心肌損傷[5]?；瘖y品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)[6]明確規(guī)定化妝品中禁止使用東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、秋水仙堿(colchicine)、阿托品和士的寧。因此,建立化妝品中有毒生物堿的檢測方法,對于保障化妝品的安全,為國家化妝品質(zhì)量監(jiān)測提供技術(shù)支撐,對完善化妝品的風險監(jiān)測技術(shù)體系具有重要意義。

目前,測定生物堿的方法主要有高效液相色譜法[7,8]、超臨界液相色譜法[9,10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-15]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16]、薄層色譜法[17]和毛細管電泳法[18]。其中,LC-MS/MS以其靈敏度高、適用范圍廣、選擇性和特異性好等優(yōu)點,成為檢測多種生物堿最為常見的方法。范素芳等[11]建立了LC-MS/MS測定食品中15種有毒生物堿的方法,并對植物源飲料、糧食及果蔬中15中生物堿進行了定量檢測。張春華等[15]建立了LC-MS/MS同時檢測尿液和胃液中12種有毒生物堿的方法,優(yōu)化了前處理過程和LC-MS/MS條件,探討了質(zhì)譜碎裂機理。目前，LC-MS/MS測定多種生物堿的基質(zhì)多集中在中草藥材[5,7-9]、食品[11]、血液[12]、胃液和尿液[15]等生物制品,化妝品相關(guān)的檢測研究較少。本研究采用超聲波提取技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一種同時測定化妝品中東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿(camptothecin)和毛果蕓香堿(pilocarpine)10種生物堿的檢測方法。該方法前處理操作簡單,檢測靈敏度高,適用于化妝品中10種有毒生物堿的安全風險篩查和定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Triple Quad 6500三重四極桿質(zhì)譜儀,配有電噴霧電離(ESI)源(美國AB Sciex公司);島津20A高效液相色譜儀(日本島津公司); 3K15高速冷凍離心機(美國Sigma公司); P300H超聲波清洗器(德國Elma公司); VORTEX 3渦旋混勻儀(德國IKA公司)。

乙腈、乙醇、甲醇均為色譜純(美國Fisher公司);正己烷為分析純(北京化學試劑公司);甲酸為色譜純(美國Supelco Analytical公司);實驗所用水均為屈臣氏蒸餾水(屈臣氏集團(香港)有限公司); 10種生物堿標準品(純度≥99%)購于上海源葉生物科技有限公司;Oasis MCX固相萃取陽離子交換柱(60 mg/3 mL)購于美國Waters公司。

1.2 標準溶液的配制

標準溶液的配制:稱取10種生物堿標準品10 mg,分別置于100 mL容量瓶中,用50%(v/v)乙醇水溶液溶解配制成100 mg/L的標準儲備液,儲存于4 ℃冰箱。

混合標準儲備溶液:分別準確移取上述標準儲備溶液各1 mL,置于100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/L的10種生物堿混合標準儲備溶液,于4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

水劑類化妝品和膏霜乳液類化妝品(水包油)樣品:準確稱取試樣約1.0 g,置于50 mL具塞塑料離心管中,準確加入15 mL 80%(v/v)甲醇水溶液,渦旋分散均勻后,超聲提取15 min, 用80%(v/v)甲醇水溶液定容至20 mL,以9 000 r/min離心10 min,移取上清液,過微孔濾膜,待測定。

膏霜乳液類化妝品(油包水)樣品:準確稱取試樣約1.0 g,置于50 mL具塞塑料離心管中,加入5 mL正己烷,分散均勻后,準確加入20 mL 80%(v/v)甲醇水溶液,超聲提取15 min,以9 000 r/min離心10 min,棄去上層正己烷后,移取下層清液,過微孔濾膜,待測定。

1.4 分析條件

色譜柱:Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm);柱溫:30 ℃;流動相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動相B:乙腈;流速:0.30 mL/min;梯度洗脫程序:0～2.0 min, 10%B; 2.0～6.0 min, 10%B～25%B; 6.0～23.0 min, 25%B; 23.0～23.1 min, 25%B～10%B; 23.1～25.0 min, 10%B。進樣量:2 μL。

離子源:ESI源,正離子模式;離子源溫度:500 ℃;噴霧電壓:5.5 kV;氣簾氣壓力:0.21 MPa;霧化氣壓力:0.34 MPa;輔助氣壓力:0.34 MPa;掃描模式:多反應監(jiān)測(MRM)模式。10種生物堿的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 10種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the ten alkaloids

* Quantitative ion.

圖 1 (a)不同提取溶劑和(b)不同體積分數(shù)的甲醇水溶液對10種生物堿回收率的影響(n=3)Fig. 1 Effect of (a) different extraction solvents and (b) different volume percentages of methanol aqueous solution on the recoveries of the ten alkaloids (n=3)

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇

生物堿的溶解性能是設置提取方法的重要依據(jù),傳統(tǒng)提取生物堿的方法有水、酸水、醇類和親酯性有機物提取等[19]。10種生物堿存在極性差異,在溶解性上也存在差異,如秋水仙素堿和阿托品易溶于水,但番木鱉堿和喜樹堿不溶于水,溶于甲醇和乙醇等有機溶劑。為更好地從化妝品中提取出10種生物堿,考察了水劑類化妝品為基質(zhì)時,乙醇-水(50∶50, v/v)甲醇-水(50∶50, v/v)和乙腈-水(50∶50, v/v)的提取效果。經(jīng)3種提取液提取后所得的回收率結(jié)果見圖1a。結(jié)果表明,用甲醇-水(50∶50, v/v)提取時,毛果蕓香堿、番木鱉堿、的士寧、阿托品和烏頭堿的回收率明顯高于另外兩種提取溶劑。雖然喜樹堿用甲醇-水(50∶50, v/v)提取的回收率較另外兩種溶劑的提取回收率低,但是回收率也達到了80%。綜合比較,實驗選用甲醇水體系作為提取溶劑。

實驗繼續(xù)考察了體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的甲醇水溶液的提取效果。通過圖1b的結(jié)果分析,對于不易溶于水的番木鱉堿、的士寧和喜樹堿而言,隨著甲醇比例的增加,3種生物堿的回收率也逐漸增加,當甲醇的體積分數(shù)升至80%以后,3種生物堿的回收率為97.5%～102.9%。其他7種生物堿的回收率隨甲醇比例變化不明顯,回收率為90.0%～103.3%。因此最終選擇80%(v/v)的甲醇水溶液為提取溶劑。

2.1.2凈化方法的考察

化妝品的基質(zhì)復雜,含有大量的表面活性劑和脂溶性物質(zhì),并且生物堿類物質(zhì)在化妝品中的含量較低。因此,為提高檢測的靈敏度,本實驗擬采用陽離子交換固相萃取柱[20]對樣品進行凈化、濃縮,選擇水劑類化妝品型爽膚水為基質(zhì),10種生物堿的添加水平為100 μg/kg,考察10種生物堿的回收率。結(jié)果表明,經(jīng)陽離子交換柱后,秋水仙堿未檢出;毛果蕓香堿、喜樹堿回收率低于60%,番木鱉堿的回收率為75.6%,其他6種生物堿的回收率為86.3%～110.7%。說明陽離子固相萃取柱不適合目標物的凈化,最終樣品前處理過程不考慮采用固相萃取凈化。

2.2 分析條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

對比了3種色譜柱Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)、Thermo Accuore-150 C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)和資生堂Capcell PAK(100 mm×2.1 mm, 2 μm)對10種生物堿的分離效果。結(jié)果表明,使用BEH C18色譜柱時,10種生物堿實現(xiàn)了基線分離,峰形良好,峰響應也較高;使用Accuore-150 C18色譜柱時,番木鱉堿和阿托品沒有基線分離;使用Capcell PAK色譜柱時,10種生物堿峰形良好,但峰面積偏小。因此實驗后續(xù)選擇BEH C18色譜柱。

實驗考察了采用0.1%(v/v)甲酸水溶液或10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相A、乙腈為流動相B對10種生物堿色譜行為和離子化程度的影響。實驗發(fā)現(xiàn),當流動相為10 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈時,毛果蕓香堿的峰形較寬且拖尾嚴重,士的寧和番木鱉堿不能基線分離,并且喜樹堿的響應值特別低。當流動相為0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈時,各種目標物的信號響應高,尤其是喜樹堿的響應強度有明顯增高,峰形尖銳對稱,分離度能滿足檢測要求。因此實驗采用0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈體系作為流動相。

2.2.2質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

10種生物堿的化學結(jié)構(gòu)中都含有雜環(huán)原子,在電噴霧電離源、正離子模式(ESI+)下易得到一個H+,形成[M+H]+準分子離子峰。選擇ESI+模式對100 μg/L的10種生物堿混合標準溶液進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。采用全掃描的方式確定各分析物的母離子,通過調(diào)整氣簾氣壓、輔助氣壓、噴霧氣壓和離子源溫度等參數(shù),使各標準物質(zhì)的[M+H]+準分子均可達到較高的響應值。采用二級質(zhì)譜掃描方式選擇響應較高的2個碎片離子,優(yōu)化碰撞能和去簇電壓值等參數(shù)。最終選定母離子和2個特征子離子進行定性分析,選擇其中響應值高的子離子的作為定量離子。10種生物堿標準物質(zhì)優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1，總離子流色譜圖見圖2。

圖 2 10種生物堿(100 μg/L)的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatogram of the ten alkaloids (100 μg/L)1. pilocarpine; 2. scopolamine; 3. strychnine; 4. brucine; 5. atropine; 6. colchicine; 7. camptothecin; 8. mesaconitine; 9. hypaconitine; 10. aconitine.

2.3 基質(zhì)效應(ME)評價

本實驗評價了化妝品基質(zhì)對10種生物堿離子化效果的影響。通過公式ME=A/B×100%評價其基質(zhì)效應。其中,A表示空白基質(zhì)液配制的標準溶液的響應值;B表示80%(v/v)甲醇水溶液配制的標準溶液的響應值。當ME大于100%時,表示存在基質(zhì)增強效應;當ME小于100%時,表示存在基質(zhì)抑制效應;當ME等于100%時,表示不存在基質(zhì)效應。實驗測定了兩種溶液配制的20 μg/L混合標準溶液的離子響應強度比值,平行測定3次。結(jié)果表明,阿托品和東莨菪堿在3種化妝品中均有明顯的基質(zhì)抑制效應,10種生物堿的平均基質(zhì)效應為56.2%～98.7%。因此本實驗選用空白基質(zhì)的提取液配制標準溶液進行定量。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

用空白基質(zhì)提取液將10種生物堿混合標準儲備液逐級稀釋成0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的混合標準工作液,在上述確定的分析條件下測定,平行測定3次。以各生物堿定量子離子的質(zhì)譜峰面積為縱坐標(Y),混合標準工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(X, μg/L)進行回歸分析,得到線性回歸方程。結(jié)果表明,10種生物堿化合物在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99。采用標準添加法來確定方法的檢出限和定量限,以3倍和10倍信噪比下各待測物的質(zhì)譜響應值計算化妝品基質(zhì)中10種生物堿的檢出限和定量限,結(jié)果見表2。

表 2 10種生物堿的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the ten alkaloids

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 方法的回收率和精密度

分別向空白水劑類化妝品和膏霜乳液類化妝品樣品中添加中1倍、2倍和6倍定量限的標準品,每個水平重復測定6次。按照1.3節(jié)方法提取并分析,計算10種生物堿的加標回收率和相對標準偏差(見表3)。結(jié)果顯示,10種生物堿在膏霜乳液、水劑類化妝品基質(zhì)的平均加標回收率為70.91%～116.75%, RSD為0.49%～9.98%,滿足標準檢測方法的要求。

表 3 化妝品中10種生物堿的回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the ten alkaloids in the cosmetics (n=6)

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

2.6 穩(wěn)定性

實驗考察10種生物堿在提取溶液中放置24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。在空白水劑類化妝品樣品中添加待測物,添加水平分別為阿托品12.5 μg/kg,次烏頭堿和新烏頭堿25.0 μg/kg,其他50.0 μg/kg。按照1.3節(jié)方法提取后,放置0、4、8、12、16、20和24 h后分別測定提取溶液中10種生物堿的峰面積,并計算其相對標準偏差。結(jié)果表明,在24 h內(nèi)提取溶液中10種生物堿峰面積的相對標準偏差為1.25%～9.02%,符合檢測要求。

2.7 實際樣品檢測

應用本方法對市場上20種含植物成分的化妝品(5種面霜、5種爽膚水、5種洗發(fā)水和5種乳液)進行檢測。結(jié)果表明,實際樣品中10種生物堿均未檢出。

3 結(jié)論

將本研究建立的分析方法應用于膏霜乳液和爽膚水等化妝品中10種有毒生物堿的檢測,均可獲得滿意的回收率和重復性。本方法前處理簡單,靈敏度高,為相關(guān)機構(gòu)對化妝品中有毒生物堿禁用組分的風險監(jiān)控提供有力的技術(shù)支撐。