陳 婷, 續(xù)艷麗, 張 文, 閆 君, 彭 濤

(蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所, 甘肅 蘭州 730050)

近年來,隨著科技的快速發(fā)展和人類生活水平的不斷提高,人們對(duì)食品安全問題越來越重視。我國作為農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國,農(nóng)藥在農(nóng)作物的增產(chǎn)增收方面發(fā)揮著重要作用[1],但大量農(nóng)藥的不合理應(yīng)用,已對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大威脅,農(nóng)藥殘留作為食品安全中的突出問題[2,3],備受廣大民眾關(guān)注。一些國際組織,如國際食品法典委員會(huì)和歐盟也已制定了食品中農(nóng)藥殘留的最大殘留限量(MRLs),并不斷開發(fā)新的技術(shù)方法加強(qiáng)對(duì)食品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)工作[4,5],確保食品安全和保障人類健康。

農(nóng)藥種類繁多、理化性質(zhì)各異,涉及的樣品基質(zhì)復(fù)雜,農(nóng)藥殘留在測(cè)定之前,需經(jīng)過萃取、凈化、濃縮等復(fù)雜的前處理步驟,因此建立一種高效、快速、安全、成本低廉的多殘留前處理方法具有重要意義。目前,農(nóng)藥殘留檢測(cè)樣品的前處理方法主要有凝膠凈化色譜法(GPC)[6]、基質(zhì)固相分散萃取法(MSPD)[7]、固相萃取法(SPE)[8]等,這些方法雖然有效,但是前處理過程消耗大量有機(jī)試劑,耗時(shí)且耗力,在檢驗(yàn)檢測(cè)中的應(yīng)用存在一定局限性。由Anastassiadas等[9]提出的QuEChERS技術(shù),因其簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn),已成為農(nóng)藥殘留快速前處理技術(shù)的首選。目前相關(guān)研究主要集中在對(duì)QuEChERS技術(shù)的優(yōu)化方面,如通過不斷優(yōu)化提取溶劑、分散固相萃取凈化劑的種類和加入量等[10-13],充分實(shí)現(xiàn)操作的方便性和良好的重復(fù)性,而對(duì)改進(jìn)QuEChERS前處理操作方式的研究較少。據(jù)統(tǒng)計(jì),農(nóng)藥殘留檢測(cè)樣品前處理的時(shí)間約占整個(gè)檢測(cè)時(shí)間的2/3[14],其中手動(dòng)QuEChERS處理由于人員操作差異會(huì)加大實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性,影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此需要一種更為快速高效的操作方式來進(jìn)行QuEChERS前處理。

因此,本文通過評(píng)估和驗(yàn)證全自動(dòng)QuEChERS樣品制備系統(tǒng),建立植物源性食品中多種農(nóng)藥殘留的前處理方法,并結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行定性及定量檢測(cè),對(duì)手動(dòng)QuEChERS法和全自動(dòng)QuEChERS法同時(shí)測(cè)定不同基質(zhì)中多農(nóng)藥殘留含量進(jìn)行了比較,為植物源性食品安全評(píng)估檢測(cè)工作提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Iclass/Xevo TQD高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧電離(ESI)源、三重四極桿線性離子阱質(zhì)量分析器及MassLynx 4.1工作站,美國Waters公司); Centrifuge 5810R高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司); VORTEX-5渦旋混勻器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); ME204/02電子天平(美國梅特勒公司); KS501搖床(德國IKA公司)。

SiO-6512 QuEChERS全自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)(配有渦流振動(dòng)離心機(jī)、12位均質(zhì)離心轉(zhuǎn)子、均質(zhì)分離工作站)購自北京Ability公司。

乙腈、丙酮、甲醇(色譜純,德國Merck公司);實(shí)驗(yàn)用水(美國Millipore公司);提取劑包(4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉、1.0 g檸檬酸鈉、0.50 g檸檬酸二鈉)、無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、聚丙烯整合管、ZrO2珠包(北京Ability公司); 34種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%,德國Dr. Ehrenstorfer公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:精密稱取10 mg(精確至0.01 mg)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品,分別置于10 mL容量瓶中,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的溶解性和測(cè)定的需要,選用丙酮或者甲醇稀釋并定容至刻度,于-18 ℃避光保存待用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:根據(jù)每種農(nóng)藥在檢測(cè)器上的響應(yīng)值,準(zhǔn)確移取一定體積的農(nóng)藥,分別置于25 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1～350 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于4 ℃避光保存。取陰性樣品制備空白基質(zhì)溶液,過0.22 μm微孔濾膜后,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1手動(dòng)QuEChERS方法

準(zhǔn)確稱取10 g試樣(含水量>10 g/100 g)或2 g試樣(含水量≤10 g/100 g)(精確至0.01 g),置于50 mL離心管中,加入10.0 mL乙腈、提取劑包、1顆陶瓷均質(zhì)子,劇烈振蕩10 min,以3 900 r/min離心5 min,吸取6 mL上清液,置于內(nèi)含凈化劑(通用凈化劑為0.6 g MgSO4、0.1 g PSA;茶葉等顏色較深的樣品凈化劑為0.6 g MgSO4、0.1 g PSA、0.02 g GCB)的QuEChERS凈化管中,渦旋混勻1 min,以3 900 r/min離心5 min,準(zhǔn)確吸取1.0 mL上清液,過0.22 μm微孔濾膜,待LC-MS/MS測(cè)定。

1.3.2全自動(dòng)QuEChERS方法

準(zhǔn)確稱取10 g試樣(含水量>10 g/100 g)或2 g試樣(含水量≤10 g/100 g)(精確至0.01 g),置于整合管外管,依次加入5 mL超純水、ZrO2珠包(24粒)、10.0 mL乙腈、提取劑包。將裝有凈化劑(同1.3.1節(jié))的內(nèi)管置于整合管中,將整合管放入SiO-6512主機(jī)中,運(yùn)行。運(yùn)行方法為以1 100 r/min振動(dòng)5 min;以4 000 r/min離心10 min;以1 100 r/min振動(dòng)5 min;以4 000 r/min離心5 min。程序結(jié)束后取出整合管,準(zhǔn)確吸取1.00 mL上清液,過0.22 μm微孔濾膜,待LC-MS/MS測(cè)定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:(A)乙腈和(B)0.1%(v/v)甲酸水溶液;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫:0～0.5 min, 5%A; 0.5～8.5 min, 5%A～95%A; 8.5～10.0 min, 95%A; 10.0～12.0 min, 5%A。進(jìn)樣量:1.0 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI源,正離子模式;離子源溫度:150 ℃;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;去溶氣溫度:400 ℃;去溶氣流速:850 L/h;毛細(xì)管電壓:3.00 kV;錐孔電壓:45 V;碰撞氣:高純氬氣(99.999%)。34種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 34種農(nóng)藥的保留時(shí)間(RT)及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times (RTs) and MS parameters of the 34 pesticides

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

* Quantitative ion.

圖 1 采用不同流動(dòng)相時(shí)34種農(nóng)藥的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms of the 34 pesticides with different mobile phasesa. methanol-water; b. methanol-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution; c. acetonitrile-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution.

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

比較了甲醇-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液和乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液3種流動(dòng)相對(duì)各化合物分離效果的影響(見圖1)。結(jié)果顯示:甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí),抑霉唑、噻菌靈色譜峰拖尾,烯酰嗎啉、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽無響應(yīng),原因是水相條件下不利于目標(biāo)化合物的電離,減弱了目標(biāo)化合物在色譜柱上的保留性,從而降低了靈敏度;甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí),氧樂果、多菌靈分離效果較差,烯酰嗎啉響應(yīng)明顯降低;乙腈-0.1%(v/v)甲酸水除個(gè)別化合物響應(yīng)略低外,其余化合物與采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水時(shí)差別不大。甲酸的加入明顯提高了靈敏度,且乙腈與甲醇相比具有更強(qiáng)的反相洗脫能力,在保證目標(biāo)化合物響應(yīng)值和分離度的前提下優(yōu)化了目標(biāo)化合物的色譜峰形。因此本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.1%(v/v)甲酸水作為流動(dòng)相。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1樣品加水量

圖 2 不同加水量對(duì)馬鈴薯和大米中34種農(nóng)藥回收率的影響Fig. 2 Effects of the different water addition on the recoveries of the 34 pesticides in potatoes and rice

依據(jù)歐洲標(biāo)準(zhǔn)[15]中采用QuEChERS法提取農(nóng)藥時(shí)的含水量要求,適量的含水量有利于目標(biāo)農(nóng)藥的提取,可顯著提高被提取農(nóng)藥的回收率。通過調(diào)整樣品加水量考察含水量對(duì)被測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果的影響。本實(shí)驗(yàn)取陰性樣品馬鈴薯(含水量>10 g/100 g)10 g和大米(含水量≤10 g/100 g)2 g,分別加入0、5、10和15 mL水,按1.3.2節(jié)處理后進(jìn)樣,并計(jì)算加標(biāo)回收率(見圖2)。結(jié)果表明:不添加水時(shí),馬鈴薯和大米試樣中各農(nóng)藥組分加標(biāo)回收率均不穩(wěn)定,且含水量較少的大米試樣經(jīng)處理后進(jìn)入凈化管的上清液體積少于1 mL,不利于后續(xù)上機(jī)實(shí)驗(yàn);加水量為5 mL時(shí),各農(nóng)藥加標(biāo)回收率在70%～120%范圍內(nèi)的農(nóng)藥數(shù)量明顯增多;當(dāng)加水量超過5 mL時(shí),會(huì)造成QuEChERS提取劑包過載,影響液液分配效率,導(dǎo)致回收率過高或過低。對(duì)于含水量較少的大米試樣,為達(dá)到較好的回收率,稱取10 g需相應(yīng)提高加水量,但水量過高會(huì)造成整合管過載且不利于后續(xù)提取。因此,綜合考慮不同食品含水量的差異,對(duì)于含水量>10 g/100 g的試樣選擇每10 g試樣加水5 mL,含水量≤10 g/100 g的試樣選擇每2 g試樣加水5 mL,以保證所有農(nóng)藥都能獲得較好的回收率。

表 2 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)Table 2 Experimentation design

2.2.2提取轉(zhuǎn)速與時(shí)間的優(yōu)化

QuEChERS全自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)將提取、離心及凈化過程整合,使其在盡可能短的時(shí)間內(nèi)從復(fù)雜的基質(zhì)中高通量分析農(nóng)藥殘留。實(shí)驗(yàn)對(duì)第一階段振蕩轉(zhuǎn)速和提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,選取振蕩轉(zhuǎn)速700、900和1 100 r/min,提取時(shí)間2、3、5和8 min,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組合處理(見表2),分析不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)各目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)振蕩轉(zhuǎn)速為1 100 r/min時(shí),提取5 min足以獲得滿意的回收率,當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加后,回收率并沒有明顯的提高。因此選擇振蕩轉(zhuǎn)速1 100 r/min,振蕩時(shí)間5 min。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)

本實(shí)驗(yàn)通過比較橘子、茶葉、大米、馬鈴薯、洋蔥空白基質(zhì)溶液配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與乙腈配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的斜率,評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)[16]。公式為ME=(mmatrix-msolvent)/msolvent×100%。其中,mmatrix、msolvent分別為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)|ME|<20%時(shí)可忽略不計(jì);當(dāng)|ME|為20%～50%時(shí)表示有基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)|ME|>50%時(shí)表示基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,全自動(dòng)QuEChERS法的基質(zhì)效應(yīng)與手動(dòng)QuEChERS法差別較小,絕大多數(shù)農(nóng)藥的ME值為負(fù)數(shù)，表現(xiàn)出基質(zhì)抑制作用。在全自動(dòng)QuEChERS法中,約70%的農(nóng)藥表現(xiàn)出較低的或可忽略的基質(zhì)效應(yīng),25%表現(xiàn)出中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng),5%表現(xiàn)出較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng);而手動(dòng)QuEChERS法中,約60%的農(nóng)藥表現(xiàn)出較低的或可忽略的基質(zhì)效應(yīng),30%表現(xiàn)出中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng),10%表現(xiàn)出較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)應(yīng)的基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正,一定程度上減弱了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物的影響。

2.4 方法的線性范圍、檢出限及定量限

本實(shí)驗(yàn)用橘子陰性樣品基質(zhì)配制不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L)、定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。向陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在本文優(yōu)化的前處理方法和儀器條件下,通過調(diào)整各目標(biāo)化合物的添加濃度,得到各目標(biāo)化合物響應(yīng)為3倍和10倍信噪比(S/N)時(shí)對(duì)應(yīng)的含量,作為檢出限(LOD)和定量限(LOD)。結(jié)果顯示:目標(biāo)化合物在一定范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,手動(dòng)QuEChERS法和全自動(dòng)QuEChERS法相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99。手動(dòng)QuEChERS法LOD為0.81～3.90 μg/kg, LOQ為2.43～11.70 μg/kg;全自動(dòng)QuEChERS法LOD為0.76～3.60 μg/kg, LOQ為2.28～10.80 μg/kg,相比手動(dòng)QuEChERS法,全自動(dòng)QuEChERS法的檢出限及定量限均低于手動(dòng)QuEChERS法,結(jié)果見表3。

2.5 方法的回收率及精密度

采用全自動(dòng)QuEChERS方法,選用不含待測(cè)農(nóng)藥的陰性樣品馬鈴薯和大米,向其中添加10.0、50.0和100.0 μg/kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)加標(biāo)水平做5次平行試驗(yàn),計(jì)算樣品加標(biāo)回收率,結(jié)果見表S1(詳見http://www.chrom-China.com)。各農(nóng)藥回收率為53.0%～125.2%, RSD<15.9%。

表 3 采用手動(dòng)和全自動(dòng)QuEChERS法時(shí)34種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R2), LODs and LOQs of the 34 pesticides by manual or automatic QuEChERS

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

為了驗(yàn)證不同基質(zhì)的回收率效果,選用不含待測(cè)農(nóng)藥的陰性樣品(橘子、綠茶、大米、馬鈴薯、洋蔥),分別向其中添加50.0 μg/kg水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,對(duì)手動(dòng)QuEChERS法和全自動(dòng)QuEChERS法進(jìn)行比較(見圖3)。結(jié)果表明,在橘子、大米、綠茶及洋蔥中,采用全自動(dòng)QuEChERS法時(shí)農(nóng)藥的回收率略高于手動(dòng)QuEChERS法;而在馬鈴薯中,采用手動(dòng)QuEChERS法時(shí)農(nóng)藥的回收率略高于全自動(dòng)QuEChERS法,可能是由于基質(zhì)效應(yīng)或含水量差異的影響。除噻蟲嗪外,全自動(dòng)QuEChERS法與手動(dòng)QuEChERS法相比大部分農(nóng)藥的回收率差異不大,均能滿足回收率要求。相比手動(dòng)QuEChERS法,全自動(dòng)QuEChERS法在滿足實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)的同時(shí)能夠降低勞動(dòng)強(qiáng)度,節(jié)約時(shí)間,提高檢驗(yàn)效率。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可行性,應(yīng)用所建立的全自動(dòng)QuEChERS法對(duì)市售豇豆、芒果、大米等植物源性食品中34種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果在豇豆、芒果、辣椒和芹菜中分別檢出多菌靈、氧樂果、克百威和烯酰嗎啉,且含量與手動(dòng)QuEChERS法相近,相對(duì)誤差<17.3%(見表4)。

圖 3 采用全自動(dòng)和手動(dòng)QuEChERS法時(shí)5種基質(zhì)中農(nóng)藥(50.0 μg/kg)回收率的箱線圖Fig. 3 Boxplot of the recoveries of pesticides (50.0 μg/kg) in five matrices using the automated and manual QuEChERS method

表 4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Test results of real samples

3 結(jié)論

本文利用全自動(dòng)QuEChERS樣品制備系統(tǒng)結(jié)合LC-MS/MS,建立了針對(duì)植物源性食品中34種農(nóng)藥的定性定量檢測(cè)方法,與手動(dòng)QuEChERS法比較,大部分農(nóng)藥回收率差異不大,但全自動(dòng)QuEChERS方法實(shí)現(xiàn)了化合物提取與凈化一步完成,方法時(shí)間短、人為影響因素小,在保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的同時(shí)大大提高了檢測(cè)效率。通過方法學(xué)考察和加標(biāo)回收試驗(yàn),表明該方法具有良好的回收率和精密度,可作為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的參考方法應(yīng)用于日常檢測(cè)中。