張俊杰，尚益民，彭姍姍，范雨晴，魏賀坤，尚紫博，范建橋

（鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

產(chǎn)香酵母是一類可以產(chǎn)生揮發(fā)性香味化合物的酵母[1-2]。產(chǎn)香功能性微生物的范圍沒有明確的定義，產(chǎn)香酵母除了能夠產(chǎn)生醇類和酯類，還能生成酮類、醛類等化合物，形成多種風(fēng)味物質(zhì)，在代謝過程中產(chǎn)生多種維生素、氨基酸，還能產(chǎn)生某些生物活性物質(zhì)，增強(qiáng)人體免疫力[3]。

蘋果營養(yǎng)豐富，但蘋果的消費(fèi)方式主要以鮮果消費(fèi)為主，消費(fèi)方式單一導(dǎo)致蘋果出現(xiàn)生產(chǎn)過剩、效益下降的尷尬局面。蘋果酒的口味柔和，兼具蘋果的水果香味，是老少皆宜的佳釀，因此，開發(fā)高品質(zhì)蘋果酒成為蘋果消費(fèi)的新趨勢(shì)。

蘋果酒中的揮發(fā)性香味物質(zhì)成分復(fù)雜多樣，已知的有上百種，主要為醇、酯、萜、醛類物質(zhì)等[4-5]。這些香味物質(zhì)有的來源于果實(shí)，有的來源于工藝階段。W ILLIAMSA A等[6]采用SweetCoppin的蘋果汁制作蘋果酒，發(fā)現(xiàn)蘋果中固有的揮發(fā)性香味物質(zhì)成分對(duì)蘋果酒的香味影響很小。根據(jù)MORTON ID等[7]報(bào)道，不同品種蘋果汁發(fā)酵的蘋果酒中，還能被分辨出是蘋果果實(shí)香氣的只有金冠等比較典型風(fēng)味的蘋果品種；其他大部分品種蘋果酒的香氣不能被辨別。尚宏芹[8]綜述了蘋果酒中主要的香氣成分及其來源，并介紹了國內(nèi)外蘋果酒中香氣成分的提取和分析方法，揭示了蘋果酒的香氣成分是構(gòu)成蘋果酒質(zhì)量的重要因素，決定著蘋果酒的風(fēng)味和典型性。于愛梅等[9-10]研究認(rèn)為蘋果中的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量對(duì)蘋果酒的影響重大。蘋果酒產(chǎn)業(yè)在我國起步相對(duì)較晚，生產(chǎn)工藝上不成熟，且發(fā)酵用的菌株來源不明，缺乏安全性和明確性，并且產(chǎn)品同質(zhì)化現(xiàn)象嚴(yán)重。因此，開發(fā)安全性高、品質(zhì)好的蘋果酒成為蘋果酒產(chǎn)業(yè)的一個(gè)重要研究方向。產(chǎn)香酵母對(duì)酒的感官風(fēng)味有特別的貢獻(xiàn)，但是目前直接應(yīng)用到低醇果酒生產(chǎn)中的產(chǎn)香酵母菌株仍很匱乏。本實(shí)驗(yàn)從赤霞珠葡萄酒釀造不同時(shí)期的發(fā)酵液中分離獲得酵母菌資源，并從中篩選出具有較好產(chǎn)香特性的菌株，研究其對(duì)蘋果酒發(fā)酵特性的影響，為該菌株今后的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

供試菌株：分離自赤霞珠葡萄酒（本實(shí)驗(yàn)室自制，其中赤霞珠葡萄采自鄭州NAPA酒莊）釀造不同時(shí)期的發(fā)酵液，共80株酵母菌株，分別編號(hào)為S1-1、3、4、8、13，S2-1～5，S3-9、11、13、14、15，S4-10～14，A1-3～7，A2-11、12、13、14、16，A3-4、10、11、14、15，A4-10 ～14，B1-1、2、5、6、7，B2-9、11、12、13、14，B3-1、3、6、11、13，B4-3、5、6、7、8，D1-11、13、18、19、20，D2-1～5，D3-2、3、10、11、12，D4-4、5、6、8、9。其中S、A、B、D對(duì)應(yīng)于發(fā)酵1d、3d、5 d、7 d，下標(biāo)1～4表示酒樣的四個(gè)重復(fù)。安琪釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母浸粉（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；葡萄糖（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Ezup柱式基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、26S rDNA D1/D2區(qū)擴(kuò)增引物NL-1和NL-4以及5.8 ITS區(qū)擴(kuò)增引物ITS-1和ITS-4：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

YEPD固體培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂粉20 g/L，自然pH，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化安泰公司；DH-600生化培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；C1000 TouchTM聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：美國Bio-Rad公司；JY023紫外分析儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株初篩

將80株供試菌株分別接種到Y(jié)EPD固體培養(yǎng)基中，28℃，避光培養(yǎng)2 d，嗅覺靈敏的人員對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行感官評(píng)估（通過嗅聞法，依據(jù)所聞到的香味濃郁程度進(jìn)行初步評(píng)估）。

1.3.2 菌株復(fù)篩

將經(jīng)過初篩得到的產(chǎn)香濃郁的7菌株進(jìn)行復(fù)篩，分別考察其對(duì)酒精、SO2、NaCl耐受性。

酒精耐受性的測定：將菌懸液接種至不同酒精含量（8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol）的YEPD液體培養(yǎng)基（接種量為1%），28℃、180 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（培養(yǎng)24 h），用比濁法判斷菌株酒精耐受性能（比較其在波長600 nm條件下的吸光度值，其值越大，表明耐受性越高，取3組重復(fù)的平均值。下同）。

SO2耐受性的測定：將菌懸液接種至不同SO2含量（100mg/m L、120mg/mL、140mg/m L、160mg/mL）的YEPD液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/m in培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（培養(yǎng)24 h），用比濁法判斷菌株耐受性能。

NaCl耐受性的測定：將菌懸液接種至不同NaCl含量（0、4%、6%、8%、10%）的YEPD液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/m in培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（培養(yǎng)24 h），用比濁法判斷菌株耐受性能[13]。

1.3.3 產(chǎn)香酵母的分子生物學(xué)鑒定方法

酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)和5.8S-ITS區(qū)序列的PCR擴(kuò)增與檢測：采用倪崢飛等[14-15]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行酵母菌株基因組DNA的提取，使用正向引物NL-1和反向引物NL-4擴(kuò)增26S rDNA D1/D2區(qū)段。使用正向引物ITS1和反向引物ITS4進(jìn)行5.8S-ITS區(qū)基因擴(kuò)增[16]，PCR反應(yīng)體系和程序參見劉愛國等[17]的研究方法，結(jié)果檢測參照張俊杰等[18]的檢測方法。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序及分類地位的確定：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列結(jié)果用MEGA 7.0軟件進(jìn)行校正，校正序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中局部序列比對(duì)基本檢索工具（basic localalignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源序列比對(duì)，確定該菌株的分類地位。

1.3.4 蘋果酒加工工藝及操作要點(diǎn)

原料前處理→蘋果榨汁→過濾殘?jiān)砑泳N→密封發(fā)酵→蘋果酒

操作要點(diǎn)：

將蘋果洗凈去皮，并切為小塊，放入榨汁機(jī)中，不加水，直接榨汁。榨汁后的汁液用八層紗布過濾兩次，并對(duì)得到的汁液進(jìn)行糖度的測定，若糖度太低則需要加入葡萄糖調(diào)節(jié)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的安琪果酒酵母和菌株B2-13按照1%的接種量，在無菌條件下接種至蘋果汁中，并加入10mmol/L亞硫酸氫鈉。蘋果汁液密封，28℃條件下發(fā)酵7 d，當(dāng)糖度＜5 g/L時(shí)，即可終止發(fā)酵，得到蘋果酒。

1.3.5 分析檢測

蘋果酒中殘?zhí)呛康臏y定[20]：采用斐林試劑法測定蘋果酒中殘?zhí)呛?；蘋果酒中可滴定酸含量的測定[20]：采用酸堿滴定法測定蘋果酒中可滴定酸含量；蘋果酒中揮發(fā)性香氣成分的測定：采用同時(shí)蒸餾法萃取酒中的香氣成分，并進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析[21]。GC-MS條件如下：

氣相色譜（GC）條件：分流方式：不分流；升溫程序：初始溫度40℃，保持3min，然后以3℃/min升至120℃，最后以8℃/min升至230℃；載氣：氦氣（He）；流速：2m L/min；檢測器溫度：230℃，入口溫度：230℃。

質(zhì)譜（MS）條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍33～350 u。將萃取好的針插入GC進(jìn)樣口，在230℃解吸附5m in[22]。

定性定量分析：蘋果酒香氣成分GC-MS檢測結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)檢索并與圖譜庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)照，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)，確認(rèn)化學(xué)成分，內(nèi)標(biāo)乙酸苯乙酯（0.668mg/m L）用于定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香菌株初篩結(jié)果分析

80株菌株經(jīng)過初步篩選，有7株供試菌株產(chǎn)香濃郁，分別編號(hào)為A2-12、B1-5、B2-12、B2-13、B4-7、S1-8、S2-4，17株菌株產(chǎn)香稍淡，19株菌株產(chǎn)香微弱，而剩余37株菌株幾乎無香味。結(jié)果表明大部分的供試菌株并不具備較好的產(chǎn)香能力。因此，將菌株A2-12、B1-5、B2-12、B2-13、B4-7、S1-8、S2-4進(jìn)行耐受性測定。

2.2 產(chǎn)香菌株復(fù)篩結(jié)果分析

以安琪酵母菌（Angel）為對(duì)照，菌株A2-12、B1-5、B2-12、B2-13、B4-7、S1-8、S2-4耐受性（耐SO2、耐NaCl、耐酒精）分析結(jié)果見表1～表3。

表1 菌株SO2耐受性結(jié)果Table 1 Results of SO2 tolerance of strains

由表1可知，8株菌對(duì)SO2都有很好的耐受性（在120mg/m L含量下生長基本不受影響，此外在160mg/m L含量下都能有較多的生長量）。其中菌株A2-12、S2-4、B4-7、Angel的耐SO2能力更加優(yōu)異（在160mg/m L含量下，生長幾乎不受影響）；菌株S1-8、B2-13、B1-5、B2-12的耐SO2能力相對(duì)較差（在140mg/m L含量下，其生長受到了明顯的抑制，在160mg/m L含量下，生長量更少）。因此，菌株A2-12、S2-4、B4-7、Angel耐受SO2能力更強(qiáng)。

表2 菌株鹽耐受性結(jié)果Table 2 Results of salt tolerance of strains

由表2可知，8個(gè)菌株在耐鹽性能均較差。在含鹽量0～8%范圍內(nèi)，隨著含鹽量的增加，8個(gè)菌株的吸光度值梯度型減少，在無鹽量條件下，所有菌株的OD600nm值都＞2.0，在含鹽量為8%的條件下，幾乎所有菌株的OD600nm值都降到了1.0以下；其中菌株S2-4的表現(xiàn)優(yōu)異，OD600nm值均大于其他菌株，尤其在含鹽量為8%的時(shí)候表現(xiàn)明顯優(yōu)異于其他菌株，OD600nm值＞1.0；菌株B2-12和Angel兩個(gè)菌株的耐鹽性能相對(duì)較差，在含鹽量為6%的時(shí)候比其他6個(gè)菌株的表現(xiàn)差，OD600nm值均＜1.0。

表3 菌株酒精耐受性結(jié)果Table 3 Results of alcohol tolerance of strains

由表3可知，8個(gè)菌株中Angel的耐酒精能力最強(qiáng)，在酒精度為8%vol和10%vol的表現(xiàn)上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他7個(gè)菌株，其他菌株在酒精度為10%vol時(shí)的菌株含量已經(jīng)幾乎為零；其中菌株B2-13相較于其他6個(gè)菌株在酒精度為8%vol表現(xiàn)優(yōu)異；菌株B2-12相較于其他菌株也表現(xiàn)出了一定的酒精耐受性。

對(duì)表1～表3的所有耐受性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明，7株菌和對(duì)照組安琪酵母在耐SO2、耐鹽性能方面的差異不顯著（P＞0.05）。但是，在酒精耐受性方面，菌株B2-13相較于其他6個(gè)菌株表現(xiàn)優(yōu)異，此外，只有該菌株在酒精度為8%vol時(shí)，OD600nm值＞1.0。因此，進(jìn)一步對(duì)菌株B2-13（分離自發(fā)酵5 d的蘋果酒樣）進(jìn)行鑒定并應(yīng)用于蘋果酒的發(fā)酵研究。

2.3 菌株鑒定結(jié)果

對(duì)菌株B2-13的26S rDNA和5.8S ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株B2-13與葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）的相似性達(dá)到99%?；?6S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株B2-13與葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）聚于一支，因此，酵母菌株被鑒定為B2-13葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）。

圖1 基于26S rDNA序列菌株B2-13的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain B2-13 based on 26S rDNA sequences

2.4 發(fā)酵蘋果酒香氣成分結(jié)果分析

香氣成分的GC-MS分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，由不同菌種發(fā)酵的蘋果酒中的香氣成分有一定的差異，在由安琪牌果酒酵母發(fā)酵的蘋果酒中，共檢出29種香氣成分，主要有酯類（10種）、醛酮類（僅有呋喃甲醛）、醇類（5種），酸類（9種）等，其中異戊醇、苯乙醇含量最高，分別為0.871mg/m L和0.481mg/m L，其次為癸酸乙酯和十二酸乙酯，分別為0.065mg/m L和0.049mg/mL，另外酸類如辛酸和癸酸分別為0.042mg/m L和0.043mg/m L。其余物質(zhì)含量很低；而在由菌株B2-13發(fā)酵的蘋果酒中，共檢出32種香氣成分，主要有酯類（6種）、醛酮類（4種）、醇類（6種）、酸類（8種）等，其中醇類如異戊醇、苯乙醇含量最高，分別為0.356mg/m L和0.135mg/mL，另外醛酮類3-羥基-2-丁酮的含量為0.160mg/mL，其余含量很低。高級(jí)醇、酯類是影響蘋果酒風(fēng)味的主要成分。綜合以上結(jié)果，與安琪牌果酒酵母相比，由菌株B2-13發(fā)酵的蘋果酒中的香氣成分更多，尤其是醛酮類的香氣成分更多。其次，含有一種特有的香氣成分醛酮類3-羥基-2-丁酮，該香氣成分更多地存在于赤霞珠葡萄酒中，并且與其他葡萄品種相比，是其特有的香氣成分。Hanseniaspora屬的菌株有較好的產(chǎn)香能力，這與趙海霞等[23]的研究結(jié)果較為一致。因此，將菌株B2-13應(yīng)用蘋果酒的發(fā)酵中，可能賦予其一定的赤霞珠葡萄酒風(fēng)味，具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

圖2 菌株Angle（A）及菌株B2-13（B）發(fā)酵蘋果酒中香氣成分測定結(jié)果Fig.2 Results of the aroma components in cider fermented by strain Angle(A)and strain B2-13(B)

3 結(jié)論

經(jīng)過初步篩選，從80株酵母菌株中篩選得到7株產(chǎn)香濃郁的菌株，對(duì)這些菌株進(jìn)行耐受性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)在耐SO2性能、耐鹽性能方面，菌株并無明顯差異，但是在耐酒精能力方面菌株B2-13較突出，該菌株經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

菌株B2-13發(fā)酵蘋果酒酒精度為4.2%vol～5.5%vol，糖度為2.6～44 g/L，共鑒定出32種香氣成分，主要有酯類（6種）、醛酮類（4種）、醇類（6種）、酸類（8種）等，其中異戊醇、苯乙醇含量最高，分別為0.356mg/m L和0.135mg/m L，另外還有赤霞珠干紅葡萄酒的特有香氣物質(zhì)3-羥基-2-丁酮（0.16mg/m L）。菌株B2-13是一株具有較好的蘋果酒發(fā)酵和產(chǎn)香性能的酵母菌株，有良好的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用前景。