蔡晴 楊連娟 高志琴 任弘瑾 楊虹 譚靜文

(上海市皮膚病醫(yī)院真菌病科，上海 200050)

侵襲性念珠菌感染的發(fā)病率逐年增高，白念珠菌的耐藥現(xiàn)象也日趨嚴(yán)峻[1]，尋找合理、有效的治療手段是臨床中亟需解決的問題。有學(xué)者提出，染色體的修飾異?？山閷?dǎo)腫瘤細(xì)胞的可逆性耐藥，白念珠菌的耐藥機(jī)制與腫瘤細(xì)胞有類似之處，如外排泵功能的活躍[2-3]。有個別研究提示組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑可增加白念珠菌對三唑類藥物的敏感性[4-5]。羅米地辛是一種雙環(huán)肽類的HDAC抑制劑，美國FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤和外周T細(xì)胞淋巴瘤。本研究以Rpd3選擇性抑制劑羅米地辛為研究對象，觀察其對氟康唑抗白念珠菌活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株4株(ATCC 90028，ATCC 64550，ATCC 62342，ATCC 44505，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)微生物菌(毒)種保藏管理中心真菌中心惠贈，我院門診收集白念珠菌臨床株11株(C2、C7、C9、C14、C15、C54、C63、C66、C73、N168、N175)，均經(jīng)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基及ITS序列分子鑒定。質(zhì)控株為克柔念珠菌ATCC 6258。

1.2 試驗(yàn)藥物

氟康唑藥粉(批號：S1331，純度>99%)，用滅菌蒸餾水配置成1280μg/mL。HDAC抑制劑Rpd3選擇性抑制劑：羅米地辛溶液(批號:S3020，濃度10 mmol/L)。以上藥物均購自Selleck公司，放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 氟康唑?qū)Π啄钪榫捏w外敏感性檢測

參考CLSI的M27-A3方案[6]配制RPMI 1640培養(yǎng)基及藥液。氟康唑在96孔板上第1～10列藥物濃度范圍為64～0.125 μg/mL。將藥物的原液稀釋至2倍受試終濃度，取100μL藥液加入受試孔，第11列及第12列加入不含藥的RPMI 1640培養(yǎng)基，作為生長對照孔及空白對照孔。通過麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)整受試菌接種終濃度約為1×103CFU/mL，加入含有藥液的平板，置于35℃培養(yǎng)箱孵育48 h。分別記錄MIC值(肉眼觀察與生長孔比較抑制50%生長程度的藥物濃度)和拖尾程度(48 h時無菌生長孔的藥物濃度)，并用酶標(biāo)儀檢測OD630nm的吸光值。上述檢測均平行三孔，隔日重復(fù)兩次。

1.4 羅米地辛對氟康唑抗白念珠菌活性的影響

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅米地辛單獨(dú)作用沒有抗白念珠菌活性，通過棋盤法篩選出兩個濃度分析羅米地辛對氟康唑抗白念珠菌活性的影響。96孔板中第1列至第10列氟康唑濃度為64～0.125 μg/mL(50 μL)，并在不同的板中分別加入2 μg/mL和4 μg/mL的羅米地辛(50μL)，第11列及第12列分別作為生長對照和空白對照。加入受試菌菌液，置于35℃培養(yǎng)箱孵育48 h。分別記錄MIC值和拖尾程度，并用酶標(biāo)儀檢測吸光值。上述檢測均平行3孔，隔日重復(fù)2次。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0軟件，將MIC值換算為對數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 受試菌株體外抗真菌藥物敏感性

各受試白念珠菌菌株對氟康唑的體外敏感性見表1。參考CLSI的M27-S4折點(diǎn)[7]，受試菌株中氟康唑敏感株、劑量依賴株、耐藥株各5株，MIC范圍在0.25～32 μg/mL。

2.2 羅米地辛對氟康唑抗白念珠菌活性的影響

羅米地辛可以增加氟康唑的抗真菌作用：加入2 μg/mL的羅米地辛后，2株受試菌MIC值降低，加入4 μg/mL的羅米地辛后，8株受試菌MIC值降低。兩組MIC值與單用氟康唑分別比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 氟康唑及氟康唑聯(lián)合羅米地辛對白念珠菌的體外抗真菌藥物敏感性

羅米地辛可以減少氟康唑的拖尾現(xiàn)象：計算48 h無菌生長孔藥物濃度與24 h MIC值的比值，比值越高代表拖尾現(xiàn)象越明顯。將結(jié)果做熱點(diǎn)圖進(jìn)行分析，可以觀察到加入羅米地辛后，受試菌株中8株比值明顯減低，說明羅米地辛減少了氟康唑的拖尾現(xiàn)象。見圖1。

圖1羅米地辛對氟康唑抗白念珠菌拖尾現(xiàn)象的影響。抑制拖尾現(xiàn)象通過計算：48 h無菌生長孔藥物濃度與24 h MIC值的比值，將比值做熱點(diǎn)圖。加入羅米地辛后，48h時受試白念珠菌的拖尾現(xiàn)象明顯減少

Fig.1Effects of romidepsin on trailing growth with fluconazole. The inhibition of trailing growth was evaluated by the ratio of the highest concentration with no sign of growth at 48 h to the MIC value at 24 h. The addition of romidepsin reduced the trailing growth of C.albicans strains at 48h

羅米地辛可以減少測試孔菌量：以敏感株ATCC 44505、劑量依賴株C7和耐藥株C63作為代表菌株進(jìn)行分析，其吸光度的折線圖表明，與單獨(dú)用氟康唑比較，高濃度藥物孔加入羅米地辛后可以明顯減少測試孔菌量，羅米地辛增加了氟康唑的抑菌活性。見圖2。

3 討 論

目前，表觀遺傳學(xué)的相關(guān)研究在腫瘤性疾病、免疫相關(guān)疾病中已廣泛開展，醫(yī)學(xué)真菌方面報道相對較少。對于白念珠菌，乙?；揎椵^甲基化修飾的作用更為重要[8]。組蛋白的乙酰化修飾與兩種酶密切相關(guān)，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和HDAC。通過影響組蛋白及非組蛋白乙?；倪^程，HDAC在基因表達(dá)調(diào)控方面具有極為重要的作用，被視為是環(huán)境信號與細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的中樞接點(diǎn)[9]。HDAC可以將乙?；鶑慕M蛋白H3、H4的N末端賴氨酸殘基上移去，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得相對致密，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子不易接近DNA，從而抑制基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC抑制劑具有抗腫瘤的作用，并已應(yīng)用于臨床，如美國上市的伏立諾他、羅米地辛及我國的西達(dá)本胺[10-11]?；诙嗨幠退帣C(jī)制的相似性(如腫瘤細(xì)胞耐藥和真菌耐藥均與外排泵的過度表達(dá)相關(guān))，并隨著白念珠菌表觀遺傳學(xué)研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；揎椗c白念珠菌的表型、毒力、體外敏感性及耐藥性均有一定相關(guān)性[4,5,12]。

圖248 h時羅米地辛對氟康唑抗白念珠菌菌量生長的影響。a. ATCC 44505;b. C7;c. C63。△：氟康唑組吸光度，○：氟康唑加2 μg/mL羅米地辛吸光度，□：氟康唑加4 μg/mL羅米地辛吸光度

Fig.2Effects of romidepsin on fluconazole activities and growth ofC.albicansstrains at 48h. a. ATCC 44505; b. C7; c. C63. △: absorbance of fluconazole, ○: absorbance of fluconazole with 2μg/mL romidepsin, □: absorbance of fluconazole with 4μg/mL romidepsin

羅米地辛是由紫色色桿菌提取合成的一種縮酚酸肽類天然產(chǎn)物，屬于雙環(huán)肽類的HDAC抑制劑，現(xiàn)被美國FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)和外周T細(xì)胞淋巴瘤(PCTL)[13-14]。對于酵母菌，HDAC主要分為3類，Ⅰ類以Rpd3為代表，Ⅱ類以Hda1為代表，Ⅲ類以Sir2為代表。羅米地辛是一種Rpd3選擇性抑制劑，主要抑制Ⅰ類HDAC，包括HDAC1和HDAC2[15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，曲古菌素a對唑類藥物的抗真菌活性有增效作用，但是該藥僅能作為試驗(yàn)用藥，且是非選擇性的HDAC抑制劑[5]。相對于曲古菌素a，羅米地辛更具有靶向性，且已經(jīng)在臨床中應(yīng)用，更具有研究和實(shí)用價值。本研究發(fā)現(xiàn)羅米地辛對氟康唑的體外活性有增效作用，主要表現(xiàn)在MIC值降低、菌量減少和抑制拖尾現(xiàn)象，對敏感株、劑量依賴株和耐藥株均有一定作用，目前國內(nèi)外尚未見報道。

研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；揎椗c白念珠菌的體內(nèi)外獲得性氟康唑耐藥密切相關(guān)[5]。組蛋白去乙?；揎椬鳛樯嫌螜C(jī)制對白念珠菌的唑類藥物獲得性耐藥有調(diào)節(jié)作用。組蛋白去乙?；揎椏稍讷@得性氟康唑耐藥形成早期通過對白念珠菌外排泵的調(diào)控來誘導(dǎo)耐藥形成：耐藥形成過程中，HDA1和RPD3表達(dá)水平均在早中期升高，穩(wěn)定耐藥形成后降低，而CDR1和CDR2表達(dá)水平變化與其同向。由于組蛋白去乙?；墒贡恍揎椀腄NA或染色質(zhì)空間構(gòu)型更為緊密，抑制基因的表達(dá)，鑒于此，我們推測組蛋白去乙?；揎棽⒉皇侵苯幼饔糜谕馀疟没颍虚g可能涉及多個通路、轉(zhuǎn)錄因子，其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，羅米地辛作為Rpd3選擇性抑制劑對氟康唑抗白念珠菌活性有增效作用，對其深入研究有助于我們進(jìn)一步闡明白念珠菌耐藥的發(fā)生機(jī)制以及尋找新的藥物靶點(diǎn)均有重要意義。

致謝：感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院真菌科劉維達(dá)教授對本文提供的幫助！