王葉葉，江 羽，梁 晨，石 崢，譚 睿,2＊＊

（1.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 成都 610031；2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031）

腦缺血是嚴(yán)重的腦血管疾病，由于顱內(nèi)血管阻塞引起腦血流異常，導(dǎo)致局灶性腦組織損傷、神經(jīng)功能失常。腦缺血在臨床腦血管疾病中最為常見，約占80%[1]，該病發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高，使患病者生活自理能力降低，嚴(yán)重危害人類健康和生活[2]。腦缺血發(fā)病后發(fā)生缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，梗死區(qū)域因缺血出現(xiàn)氧化應(yīng)激和興奮性毒性，破壞水電離子平衡，造成梗死灶神經(jīng)元死亡，接著神經(jīng)炎癥激活，慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致腦水腫和半暗帶區(qū)神經(jīng)元死亡，從而影響神經(jīng)功能恢復(fù)[3]。腦缺血過程中一個(gè)重要特點(diǎn)是神經(jīng)元大量且快速凋亡，再灌注后很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)神經(jīng)元仍然持續(xù)凋亡。目前處于臨床研究階段的藥物主要包括溶栓藥、神經(jīng)保護(hù)劑兩類。但溶栓藥安全性低、治療時(shí)間窗窄，神經(jīng)保護(hù)劑絕大多數(shù)臨床療效較差，促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)元再生等缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的研究受到廣泛關(guān)注，包括干細(xì)胞、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、小分子藥物等[4]，其中，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能促進(jìn)突觸和軸突重塑及再生，促使神經(jīng)功能再生[5]，補(bǔ)充神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）對(duì)于保護(hù)神經(jīng)元具有重要意義[6]。NGF 能促進(jìn)軸突定向再生[7]，使之與靶細(xì)胞形成功能連接，最終修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞，達(dá)到改善神經(jīng)功能缺損癥狀的目的。但是NGF 難以在腦組織中維持理想濃度，直接給予NGF難以發(fā)揮穩(wěn)定的生物學(xué)效應(yīng)。目前已有人提出重組細(xì)胞注入法，置管腦外注藥法，神經(jīng)通路給藥法等[8-9]新的給藥方式給藥，以期NGF達(dá)到更穩(wěn)定的效應(yīng)。

白楊素（Chrysin）為5,7-二羥基黃酮，是中藥材益智仁的主要黃酮類成分之一，曾從紫葳科植物木蝴蝶中提取得到，是一種具有抗腫瘤、抗焦慮、抗炎、抗氧化等藥理活性的黃酮類化合物[10]，它可以通過上調(diào)Nrf2-ARE 信號(hào)通路相關(guān)蛋白而激活大鼠體內(nèi)抗氧化酶系和自由基清除系來減輕這些物質(zhì)對(duì)大鼠腦組織造成的損傷，對(duì)腦缺血有治療作用[11]。另外，白楊素也可能通過上調(diào)p-ERK、同時(shí)下調(diào)NF-κB和p-P38的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用[12]。然而，對(duì)于白楊素對(duì)腦缺血再灌注損傷中如何修復(fù)受損神經(jīng)元方面無報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過建立的NGF 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子藥物篩選模型，發(fā)現(xiàn)白楊素具有潛在的腦缺血后神經(jīng)保護(hù)作用，在體外實(shí)驗(yàn)中，用白楊素誘導(dǎo)MSC，檢測(cè)出MSC 細(xì)胞表面多種神經(jīng)標(biāo)志性蛋白。而后在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，用不同劑量白楊素對(duì)腦缺血再灌注大鼠治療，腦梗死、含水量均一定程度降低，且大鼠腦組織NGF、BDNF蛋白也較對(duì)照組明顯增加，進(jìn)而顯示出白楊素通過上調(diào)NGF、BDNF蛋白表達(dá)發(fā)揮腦缺血后神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物和試劑

大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞（PC12 細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所）；MSC 細(xì)胞（自提，來源于3-4 周齡SD 大鼠骨髓間充質(zhì)）；高糖DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone，J180003)，L-谷氨酸溶液(Glu，LEAGENE，0404A18)；四甲基偶氮唑鹽（MTT 粉末，銳賽生物公司，180315）；DAPI（谷歌生物有限公司，20180326）；FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（碧云天生物技術(shù)公司，A0562）；NGF一抗（谷歌生物，GB11143）；BDNF 一抗（谷歌生物，GB11240）；熒光二抗CY3 山羊抗兔（谷歌生物，GB-21303）；GalC 一抗（Solarbio，K003717P）；Nestin 一抗（碧云天生物技術(shù)公司，AF2215）；NSE一抗（碧云天生物技術(shù)公司，AF2164）；Vimentin 一抗（Abbkine，ABP-52697）；2，3，5—氯化三苯基四氮唑（TTC）（源葉生物科技有限公司，BCBR5460V）；4%多聚甲醛（Biosharp，180119）；蘇木素染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，G1005）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60 只6-8 周齡SD 雄性大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量約280-300 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞存活率檢測(cè)

PC12 細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清，105 U/L 青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，在37℃含5%CO2的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12 細(xì)胞按照2×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，設(shè)置空白組、對(duì)照組、谷氨酸損傷組和白楊素給藥組。給藥組24 h 后加入5、10、20、30、50 μM濃度的Chrysin。繼續(xù)孵育24 h后各組加入10 mMGlu溶液誘導(dǎo)24 h，對(duì)照組不做處理。每孔加入20 μL終濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，培養(yǎng)2-4 h，棄去上清，加入150 μL DMSO振蕩10 min后于570 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)取OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率[13]。

1.3.2 白楊素誘導(dǎo)MSC后蛋白含量測(cè)定

以NGF 為靶點(diǎn)，利用NGF 的啟動(dòng)子連接Luc 熒光素酶報(bào)告基因，構(gòu)建質(zhì)粒模型，并轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK-293細(xì)胞，建立可用于篩選具有促NGF分泌作用的人胚腎上皮細(xì)胞藥物篩選模型。通過此模型篩選出中藥單體白楊素具有潛在神經(jīng)保護(hù)作用，并進(jìn)一步檢測(cè)了白楊素誘導(dǎo)后1、3、5、7 天的MSC 細(xì)胞表面神經(jīng)標(biāo)志物NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin的表達(dá)量。

取3-4周齡SD大鼠，無菌環(huán)境下取其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，DMEM 低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。適宜密度的MSC接種于六孔板中，1 μM 白楊素預(yù)處理24 h 后，加入山羊血清室溫封閉30 min 后吸除，滴加一抗，4℃孵育過夜，加FITC 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，復(fù)染核后封片，觀察、采集圖像。

1.3.3 白楊素誘導(dǎo)MSC 對(duì)大鼠腦缺血再灌注的腦神經(jīng)保護(hù)作用

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行5-7天適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由飲水，正常飲食。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分組，將SPF級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分成5組：假手術(shù)組（Sham），模型組（Model），白楊素（Chrysin）高、中、低劑量治療組，每組動(dòng)物12 只。治療組大鼠均灌胃給藥，高、中、低劑量治療組劑量分別為20 mg·kg-1，10 mg·kg-1，5 mg·kg-1。造模24 h 前給藥預(yù)保護(hù)一次，造模成功后再連續(xù)給藥3天。給藥總體積為10 mL·kg-1。

（2）腦缺血再灌注損傷模型的制備

各組大鼠均在灌胃給藥預(yù)保護(hù)1 天后，禁食不禁水12 h，進(jìn)行手術(shù)，參照Longa 等[14]的方法制備MCAO模型，腹腔麻醉大鼠，在頸部中間切開，鈍性分離肌肉，暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），頸外動(dòng)脈（ECA），頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），近心端結(jié)扎CCA，動(dòng)脈夾夾閉ICA，在CCA上開一小口，從CCA插入線栓，順著ICA入顱至中動(dòng)脈，用縫合線縫合傷口，缺血2h 后進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組除不插入線拴外其余步驟同上。

圖1 不同濃度白楊素作用下PC12谷氨酸損傷細(xì)胞的存活率

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 MCAO損傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

根據(jù)Zea Longa 五分制法[15]對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能（modified Neurological Severity Scores，mNSS）評(píng)分。在缺血再灌注后2 h、1天、2天、3天分別評(píng)分。

1.4.2 大腦梗死體積比的測(cè)定

股動(dòng)脈取血后立即取腦，去除嗅球和小腦，沿冠狀面切成厚度為2 mm的腦片，共5片。放在20 mL的2%TTC 磷酸鹽緩沖液（pH7.6）中，避光，在37 度水浴30 min，染色后，用4%多聚甲醛固定，拍照，計(jì)算梗死體積，計(jì)算梗死體積比[16]。

1.4.3 腦組織含水量測(cè)定

缺血2 h 后再灌注5 天，斷頭處死大鼠，將腦完整取出，除去小腦、低位腦干以及嗅球。用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱量腦濕重，然后再將腦組織進(jìn)行烘干(105℃，24 h)后稱重，按干濕重法計(jì)算腦組織含水量。計(jì)算公式：腦組織含水量（%）=（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%[17]。

1.4.4 腦組織缺血半暗區(qū)組織學(xué)改變和海馬CA1 區(qū)NGF，BDNF蛋白表達(dá)

取腦組織，4%多聚甲醛固定，HE 染色，顯微鏡觀察缺血半暗區(qū)的變化；免疫熒光染色觀察海馬CA1區(qū)NGF，BDNF蛋白的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用Graphpad Prism7 和SPSS18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示。多組數(shù)據(jù)之間的比較使用單因素方差分析分析結(jié)果。P ＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞存活率

細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)（圖1），與谷氨酸損傷對(duì)照組相比，在5、10、20、30 和50 μM 的白楊素藥物濃度作用下，白楊素干預(yù)組細(xì)胞存活率均有上升，其中5、10 μM的白楊素作用下細(xì)胞存活率上升顯著（P ＜0.01），20、30 μM的白楊素作用下細(xì)胞存活率上升明顯（P ＜0.05）（圖1）。對(duì)正常PC12 細(xì)胞沒有毒性且在谷氨酸（10 mM）誘導(dǎo)下又對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用的白楊素藥物濃度為10 μM。

2.2 白楊素誘導(dǎo)MSC后蛋白含量測(cè)定

MSC 細(xì)胞表面神經(jīng)標(biāo)志物NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin均有表達(dá)（圖2），3天時(shí)NSE表達(dá)突出，5天時(shí)NGF、Nestin、Vimentin 表達(dá)較多。經(jīng)白楊素誘導(dǎo)后，MSC細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白表達(dá)增加。

2.3 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，腦梗死體積及含水量

結(jié)果表明（表1），與模型組比較，假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為0，給藥組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均具有不同程度的減小，10 mg·kg-1和20 mg·kg-1劑量白楊素給藥后2天和3天缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低（P ＜0.05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死明顯（圖3a,b），模型組腦含水量顯著增加（P ＜0.05）（圖3c）。與模型組相比，Chrysin給藥組腦梗死體積均減少，10 mg·kg-1和20 mg·kg-1劑量Chrysin組梗死體積比與模型組有顯著差異（P ＜0.05）（圖3b），且隨劑量增加，梗死體積逐漸減小。與模型組相比，給藥組腦含水量均有一定降低，但沒有顯著性差異（P ＞0.05）（圖3c），提示白楊素可一定程度減輕神經(jīng)功能損傷癥狀。

2.4 大鼠腦缺血半暗區(qū)組織學(xué)染色及海馬CA1 區(qū)NGF、BDNF蛋白熒光染色

大鼠腦缺血半暗區(qū)組織學(xué)染色顯示（圖4），假手術(shù)組神經(jīng)元排列整齊緊密，層次清楚，核膜完整，核仁清晰可見；模型組出現(xiàn)細(xì)胞間隙變寬，細(xì)胞形態(tài)極不規(guī)則，深染，核固縮，溶解等細(xì)胞壞死特征。與模型組相比，給藥組大鼠神經(jīng)細(xì)胞病變較輕，且Chrysin-20 mg·kg-1組細(xì)胞間聯(lián)系緊密，空泡狀減少，治療效果顯著。

免疫熒光染色法對(duì)腦組織NGF、BDNF 蛋白進(jìn)行染色（圖5），與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦海馬CA1區(qū)NGF、BDNF蛋白熒光強(qiáng)度降低，提示其表達(dá)量顯著降低（P ＜0.05）；與模型組相比，給藥組大鼠腦海馬CA1區(qū)NGF、BDNF蛋白紅色熒光表達(dá)有明顯增加，且隨著給藥劑量增加，熒光強(qiáng)度增大，說明在缺血再灌注損傷后，給Chrysin大鼠腦海馬CA1區(qū)NGF、BDNF有一定程度增加，這對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞有一定的修復(fù)作用。

圖2 楊素誘導(dǎo)MSC后不同時(shí)間細(xì)胞表面神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin的免疫熒光表達(dá)（a）×400及表達(dá)量（b）

圖3 大鼠腦部TTC染色（a；白色區(qū)域代表梗死部位；紅色區(qū)域?yàn)檎２课唬?；腦梗死體積（%）（b；￥P ＜0.05：與模型組相比）；腦含水量（%）（c；￠P ＜0.05：與假手術(shù)組相比）

表1 各組不同時(shí)間神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（xˉ±s,n=12）

3 討論

據(jù)報(bào)道，神經(jīng)保護(hù)治療能恢復(fù)神經(jīng)功能[18]，神經(jīng)元的存活及維持正常功能依賴于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[19]，由于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子多為大分子肽，難以通過血腦屏障，外周給藥難以到達(dá)作用部位，充分誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)可能是治療缺血-再灌注神經(jīng)元損傷的重要途徑[20]，而BDNF 和NGF 是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的重要成員，并且腦缺血后腦神經(jīng)細(xì)胞受損程度與BDNF和NGF的表達(dá)含量密切相關(guān)[20,21]。

圖4 大鼠腦缺血半暗區(qū)HE染色×100

圖5 大鼠腦海馬CA1區(qū)NGF蛋白（a）、BDNF蛋白（b）熒光染色×100（藍(lán)色：DAPI，紅色：目標(biāo)蛋白）

本實(shí)驗(yàn)通過藥物篩選模型，發(fā)現(xiàn)白楊素具有潛在神經(jīng)保護(hù)作用，將白楊素誘導(dǎo)MSC細(xì)胞后檢測(cè)MSC細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志性蛋白，得到NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin 五種神經(jīng)標(biāo)志蛋白的較好表達(dá)，說明了白楊素可以誘導(dǎo)MSC 細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，通過建立腦缺血-再灌注動(dòng)物模型考察了不同劑量給藥組神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積、腦含水量的變化，結(jié)果顯示白楊素具有減輕缺血-再灌注損傷中神經(jīng)損傷的作用，同時(shí)對(duì)各組腦缺血半暗帶進(jìn)行組織學(xué)染色，觀察到給藥后組織空泡減少，聯(lián)系緊密，病變減輕。此外，給藥后，損傷部位的NGF、BDNF神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)上調(diào)也表明白楊素對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞有修復(fù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了上調(diào)內(nèi)源性的干細(xì)胞表達(dá)NGF、BDNF 營(yíng)養(yǎng)因子是白楊素治療腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。

綜上所述，白楊素通過上調(diào)腦缺血-再灌注損傷中NGF和BDNF蛋白表達(dá)，減輕神經(jīng)損傷癥狀，發(fā)揮治療神經(jīng)元損傷的作用。這為缺血性腦損傷的治療提供了新的思路，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。