沈丹丹 曾令高 許娟 肖波,*

(1 重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121；2 重慶市化學(xué)藥品質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 401121；3 重慶仁澤醫(yī)藥科技有限公司，重慶 400021)

環(huán)索奈德是由Altana Pharma AG(已被武田制藥公司收購(gòu))開發(fā)的一種適用于支氣管哮喘和過(guò)敏性鼻炎的皮質(zhì)類固醇。該藥物是前體藥物，能水解成活性代謝產(chǎn)物去異丁?；h(huán)索奈德。環(huán)索奈德首先是作為治療成人哮喘的藥物，以商品名Alvesco?，于2005年1月在英國(guó)上市，現(xiàn)已在包括美國(guó)、歐盟和日本各國(guó)在內(nèi)的26個(gè)國(guó)家上市。此后，作為治療過(guò)敏性鼻炎的藥物，以水性鼻噴霧劑的劑型，由Nycomed公司在加拿大、阿根廷、巴西、墨西哥、香港、韓國(guó)、馬來(lái)西亞上市；由Sunovion公司在美國(guó)上市，商品名Omnaris。用于治療成人和12歲以上兒童季節(jié)性和常年性過(guò)敏性鼻炎所引起的鼻部癥狀。2008年1月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)追加批準(zhǔn)本品用于6歲以上兒童季節(jié)性過(guò)敏性鼻炎的治療[1]。

本品的混懸型鼻噴霧劑型，微粉化環(huán)索奈德混懸于處方中。對(duì)于混懸產(chǎn)品，藥物粒徑對(duì)于溶出速率及在鼻內(nèi)起效部位的利用率可能是重要的，應(yīng)控制活性成分的粒度分布。按照中國(guó)藥典(ChP)2015四部通則0982粒度和粒度分布測(cè)定法[2]和FDA《鼻腔噴霧劑，吸入溶液、混懸液，及噴霧藥品——化學(xué)、制造及控制文件》的要求[3]，本文研究建立了微粉化環(huán)索奈德的粒徑分布測(cè)定法，按照相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，并與顯微鏡技術(shù)進(jìn)行比較，進(jìn)一步確定本方法的準(zhǔn)確性。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)儀器

激光粒度儀器系統(tǒng)(主機(jī)：Mastersizer 2000-激光粒度儀、樣品處理單元：Hydro MU、軟件版本：Mastersizer 2000版5.12C，英國(guó)Malvern公司)；Morphologi G3顆粒粒度及粒形圖像分析儀(英國(guó)Malvern公司)。

1.2 藥品與試劑

吐溫20(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：101075-201602，含量：99.7%)；六偏磷酸鈉(南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)：20161104，含量：99.0%)；焦磷酸鈉(南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)：20161104，含量：99.0%)；環(huán)索奈德(自制，批號(hào)：20180122，含量：99.9%)；微粉化環(huán)索奈德(自制，批號(hào)：20180212、20180301、20180302、20180303)；去離子水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定參數(shù)

樣品處理單元設(shè)置：泵轉(zhuǎn)速：2000r/min；超聲能量：12.5；超聲定時(shí)：120s。

儀器檢測(cè)參數(shù)設(shè)置：光學(xué)特性：樣品物質(zhì)名稱：默認(rèn)(Default)；分散劑名稱：水(water)。

結(jié)果計(jì)算：模型：通用；計(jì)算敏感度：常規(guī)；顆粒形狀：不規(guī)則；測(cè)量次數(shù)：2；樣品測(cè)量時(shí)間：10s；樣品測(cè)量快照：10000；背景測(cè)量時(shí)間：10s；背景測(cè)量快照：10000。

遮光度界限：下限10%；上限15%，重復(fù)測(cè)量：測(cè)量循環(huán)數(shù)：2；測(cè)量之間延遲：5s。

平均結(jié)果：從測(cè)量創(chuàng)建平均結(jié)果記錄，分散劑：500mL經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾的去離子水或注射用水，表面活性劑及濃度：吐溫20(0.01%，W/W)。

2.2 測(cè)定方法

2.2.1 供試品混懸液的配制

取吐溫20，加入經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾的去離子水或注射用水(分散劑)，配制成0.01%W/W的水溶液。取適量(0.05g)微粉化的環(huán)索奈德，加入吐溫20溶液(20mL)，用平勺混合均勻。

2.2.2 測(cè)定法

按照Mastersizer 2000-激光粒度儀操作規(guī)程操作。向分散池中加入500mL經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾并超聲脫氣的去離子水，選擇手動(dòng)測(cè)定模式。按照“2.1”項(xiàng)下設(shè)定儀器參數(shù)，背景測(cè)量后，緩緩加入供試品，至遮光度狀態(tài)條進(jìn)入綠色部分后，進(jìn)行測(cè)量。

2.3 檢測(cè)條件的選擇

依次選擇分散劑、表面活性劑、超聲條件，決策樹流程圖見圖1[4]。

2.3.1 分散劑的選擇

根據(jù)國(guó)外上市產(chǎn)品說(shuō)明書中公布的理化性質(zhì)，環(huán)索奈德溶解于N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇(純度99.5%)，極微溶解于正己烷、不溶解于水[5]。因此首選去離子水作為分散劑。取微粉化環(huán)索奈德原料藥適量，加入去離子水，充分?jǐn)嚢瑁梢姯h(huán)索奈德粉末無(wú)法完全分散在去離子水中，小部分混懸在去離子水中并有團(tuán)聚現(xiàn)象，大部分則呈漂浮狀態(tài)，因此需使用表面活性劑。

2.3.2 表面活性劑或穩(wěn)定劑的選擇

環(huán)索奈德在1-辛醇與pH7.4磷酸鹽緩沖液之間的分配系數(shù)(logP)為5.1，屬弱極性化合物。按照ISO 14887:2000的要求[6]，選擇六偏磷酸鈉(穩(wěn)定劑)、焦磷酸鈉(穩(wěn)定劑)和吐溫20(表面活性劑)進(jìn)行篩選。取微粉化環(huán)索奈德0.05g，置于50mL燒杯中，加入不同濃度的表面活性劑或穩(wěn)定劑水溶液20mL，充分?jǐn)嚢韬蟪?min，觀察是否有團(tuán)塊沉積在燒杯底部或絮凝現(xiàn)象，結(jié)果見表1。

結(jié)果表明：極低濃度(＞0.001g/L)的吐溫20表面活性劑就足以改善顆粒的潤(rùn)濕，能有效穩(wěn)定分散微粉化的環(huán)索奈德。使用高濃度可能會(huì)在分散裝置內(nèi)產(chǎn)生氣泡，可能造成樣品中有大顆粒的不實(shí)測(cè)定結(jié)果，因此在供試品配制時(shí)加入0.01%W/W的吐溫20。

2.4 專屬性試驗(yàn)

表1 表面活性劑或穩(wěn)定劑浸潤(rùn)微粉化環(huán)索奈德的結(jié)果Tab.1 Results of infiltration of micronized ciclesonide with surfactants or stabilizers

取吐溫20，加入注射用水(分散劑)，配制成0.01%W/W的水溶液。取4mL吐溫20溶液，加入至500mL注射用水中，依法檢測(cè)。結(jié)果表明：空白樣品遮光度為0，說(shuō)明分散劑、表面活性劑在該測(cè)定條件下不影響微粉化環(huán)索奈德的粒度測(cè)定。

2.5 測(cè)定過(guò)程中的分散穩(wěn)定性

整個(gè)測(cè)定過(guò)程中包含3個(gè)階段：(1)攪拌和泵分散階段；(2)超聲分散階段；(3)超聲后測(cè)定階段。為了考察測(cè)定過(guò)程中的樣品是否充分分散并達(dá)到穩(wěn)定分散階段，設(shè)定等時(shí)間距的測(cè)量循環(huán)數(shù)和測(cè)量之間延遲，分別在上述3個(gè)階段實(shí)時(shí)跟蹤粒徑變化；同時(shí)考察樣品是否在測(cè)定過(guò)程中發(fā)生溶解行為。以泵轉(zhuǎn)速：2000r/min；超聲能量：12.5；超聲定時(shí)：140s；測(cè)量循環(huán)：20，其余參數(shù)同“2.1”項(xiàng)。

根據(jù)粒度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果(表2)：(1)攪拌和泵分散階段：此時(shí)遮光度基本無(wú)變化，未見遮光度迅速下降，表明被測(cè)物質(zhì)未溶解于所選分散劑中，從而印證分散劑和表面活性劑選擇是合理的。(2)超聲分散階段(圖2～3)：隨著超聲時(shí)間的增加，粒徑趨于穩(wěn)定的平臺(tái)期，這表示為完全分散狀態(tài)。未見粒徑隨時(shí)間的推移不斷減小，這表明在超聲過(guò)程中未發(fā)生顆粒碎裂。(3)超聲后測(cè)定階段：粒徑和遮光度均保持穩(wěn)定，表明此分散條件是優(yōu)選的。

表2 粒度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果Tab.2 Real-time monitoring results of particle size

圖2 分散過(guò)程中粒徑變化的曲線Fig.2 Curve of particle size change during dispersion

圖3 分散過(guò)程中遮光度變化的曲線Fig.3 Curve of laser obscuration change during dispersion

2.6 耐用性試驗(yàn)

為了考察測(cè)定條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)，粒度測(cè)定結(jié)果受到影響的程度，考察了以下幾個(gè)典型變動(dòng)因素：泵轉(zhuǎn)速、遮光度、超聲時(shí)間、超聲強(qiáng)度及樣品測(cè)量時(shí)間。

2.6.1 泵轉(zhuǎn)速的影響

通過(guò)粒徑測(cè)定值如何隨泵轉(zhuǎn)速增加而變化來(lái)優(yōu)化泵/攪拌器速度。設(shè)定泵轉(zhuǎn)速：300、500、700、1000、1500、2000、2500和3000r/min，其余參數(shù)同“2.1”項(xiàng)下，考察粒徑隨著泵轉(zhuǎn)速增加的變化情況。以泵速為橫坐標(biāo)、粒徑為縱坐標(biāo)作圖如下(圖4)。

結(jié)果表明：在低速時(shí)，粒徑測(cè)定值較大；在較高泵速(1000～3000r/min)，粒徑測(cè)定值達(dá)到平臺(tái)值，粒徑保持不變。在這時(shí)，顆粒被正確置于測(cè)定池中。泵速應(yīng)設(shè)置在此范圍內(nèi)的中央(應(yīng)約為2000r/min)。但不應(yīng)默認(rèn)為使用最快泵速，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致產(chǎn)生氣泡。因此確定泵轉(zhuǎn)速為2000r/min。

2.6.2 遮光度的影響

必須確定樣品濃度，以便獲得可重現(xiàn)的散射數(shù)據(jù)，而不出現(xiàn)多重散射。對(duì)于細(xì)顆粒測(cè)量(尺寸＜10μm)，要求在不超過(guò)10%遮光率下測(cè)定。對(duì)于較粗的物質(zhì)測(cè)量，可使用高達(dá)20%的遮光度，以便增大信號(hào)噪聲比?？赏ㄟ^(guò)穩(wěn)定分散體的粒徑測(cè)定結(jié)果與遮光度的對(duì)應(yīng)關(guān)系來(lái)判斷出現(xiàn)多重散射的濃度。本研究遮光度分別為：3.42%、5.01%、8.25%、9.80%、12.63%、15.14%和21.52%，其余參數(shù)同“2.1”項(xiàng)，考察粒徑隨著遮光度增加的變化情況(圖5)。

圖4 泵轉(zhuǎn)速對(duì)粒度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.4 Influence of pump speed on particle size measurement

圖5 遮光度對(duì)粒度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.5 Influence of laser obscuration on particle size measurement

結(jié)果表明：在過(guò)低遮光度(≤5%)時(shí)，粒徑的測(cè)定值很大，這可能是因?yàn)楸尘霸肼暤挠绊?；在適當(dāng)?shù)恼诠舛?10%～15%)時(shí)粒徑的測(cè)定值是保持不變的；在較高遮光度(＞15%)時(shí)，粒徑測(cè)定值略有變小，可能因?yàn)榘l(fā)生多重散射。因此確定遮光度范圍為10%～15%。

2.6.3 超聲時(shí)間的影響

通過(guò)粒徑測(cè)定值如何隨超聲時(shí)間增加而變化來(lái)優(yōu)化超聲條件。設(shè)定超聲時(shí)間：0、30、60、90、120、150、180、210和240s，其余參數(shù)同“2.1”項(xiàng)，考察粒徑隨著超聲時(shí)間增加的變化情況(圖6)。

結(jié)果表明：當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到90s以上，粒度測(cè)定結(jié)果基本保持不變，但是應(yīng)避免過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲，以免可能造成顆粒碎裂。因此確定超聲時(shí)間為120s。

2.6.4 超聲強(qiáng)度的影響

通過(guò)粒徑測(cè)定值如何隨超聲強(qiáng)度增加而變化來(lái)優(yōu)化超聲條件。設(shè)定超聲強(qiáng)度：5.00、7.50、10.00、12.50和15.00，其余參數(shù)同“2.1”項(xiàng)，考察粒徑隨著超聲強(qiáng)度增加的變化情況(圖7)。

根據(jù)超聲強(qiáng)度的篩選結(jié)果：當(dāng)超聲強(qiáng)度達(dá)到7.5以上，粒度測(cè)定結(jié)果基本保持不變，但是應(yīng)避免強(qiáng)烈的超聲，以免可能造成顆粒碎裂。因此確定在超聲強(qiáng)度為12.5。

2.6.5 樣品測(cè)定的影響

通過(guò)粒徑測(cè)定值如何隨樣品測(cè)定時(shí)間增加而變化來(lái)優(yōu)化樣品測(cè)定時(shí)間。設(shè)定樣品測(cè)量時(shí)間：5、10、15、20和30s，樣品測(cè)量快照：5000、10000、15000、20000和30000，背景測(cè)量時(shí)間：5、10、15、20和30s，背景測(cè)量快照：5000、10000、15000、20000和30000，其余參數(shù)同“2.1”項(xiàng)下，考察粒徑隨著樣品測(cè)定時(shí)間增加的變化情況(圖8)。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)粒度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.6 Influence of ultrasonic time on particle size measurement

圖7 超聲強(qiáng)度對(duì)粒度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.7 Influence of ultrasonic energy on particle size measurement

圖8 樣品測(cè)定時(shí)間對(duì)粒度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.8 Influence of sample measurement time on particle size measurement

根據(jù)超聲強(qiáng)度的篩選結(jié)果表明：樣品測(cè)定時(shí)間和背景測(cè)量時(shí)間在5～30s范圍內(nèi)，粒度測(cè)定結(jié)果基本保持不變。

2.7 精密度試驗(yàn)

按照“2.2.1”配制供試品混懸液，按照“2.1”項(xiàng)下設(shè)定參數(shù)，連續(xù)測(cè)定同一樣品6次(測(cè)量循環(huán)數(shù)：6)，記錄粒度檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明連續(xù)測(cè)定6次，d0.1、d0.5及d0.9的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.0%，系統(tǒng)精密度良好(圖9)。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)USP34＜429＞[7]對(duì)于平行測(cè)定的要求：粒度分布的中心值(Dv50)的變異系數(shù)應(yīng)小于10%；遠(yuǎn)離中心值(Dv10和Dv90)的變異系數(shù)不得超過(guò)15%，數(shù)值小于10μm時(shí)，則變異系數(shù)的最大允許值可放寬一倍。取同一批樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下配制3份供試品，按照“2.1”項(xiàng)下設(shè)定參數(shù)，粒度測(cè)定結(jié)果如下(圖10和表3)，同一批次微粉化環(huán)索奈德3次代表性取樣的Dv10、Dv50及Dv90的變異系數(shù)均符合美國(guó)藥典的規(guī)定。

2.9 與參比技術(shù)(顯微鏡法)測(cè)定結(jié)果的比較

儀器型號(hào)：Morphologi G3顆粒粒度及粒形圖像分析儀，檢測(cè)法：按照“2.2.1”項(xiàng)下配制供試品。將樣品置于載玻片上，上面放蓋玻片。在Morphologi G3上按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行測(cè)量[8]。

對(duì)比3個(gè)批次微粉化環(huán)索奈德的顯微鏡微觀粒度測(cè)定結(jié)果與激光衍射法測(cè)定粒度(表4和圖11)，二者基本吻合，說(shuō)明開發(fā)的激光衍射法適用于微粉化活性成份的粒度測(cè)定，可作為中間體控制檢測(cè)方法。

3 討論

使用濕法分散進(jìn)行粒度測(cè)定是迄今為止用于獲得可重現(xiàn)的激光衍射結(jié)果最廣泛的方法。濕法分析為跨越寬廣粒徑范圍的樣品提供了分散方法，涵蓋從亞微米顏料到砂粒和沉積物。對(duì)于大顆?；蚨喾稚⑿苑植俭w，濕分散劑的黏度能確保測(cè)定無(wú)偏差，因?yàn)楹苋菀卓朔w粒沉降的影響。由于各種濕分散劑可用于激光衍射測(cè)定，很容易實(shí)現(xiàn)不同顆粒體系的分散。還可通過(guò)某些方法優(yōu)化分散穩(wěn)定性，而干法測(cè)定則不能。這是由于當(dāng)顆粒被分散劑潤(rùn)濕后，可獲得比干粉分散體系更大的分散能量。因此，濕法分析往往是用于可重現(xiàn)性分散亞微米材料的唯一方法且是粗大材料的優(yōu)選方法，尤其是牢固緊密聚集的粉末。在濕法分析中，顆粒的脆性也不是太大問(wèn)題，因?yàn)榕c干法分析相比，這種分散方法的破壞性更小。

圖9 精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果疊加圖Fig.9 Results of precision test

圖10 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果疊加圖Fig.10 Results of repeatability test

表3 重復(fù)性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Results of repeatability test

表4 激光衍射法與顯微鏡法測(cè)定的粒度結(jié)果比較Tab.4 Comparison of particle size results measured by laser diffraction and image analysis

圖11 顯微鏡法粒度測(cè)定結(jié)果Fig.11 Results of particle size measured by microscopy method

當(dāng)進(jìn)行濕法激光衍射測(cè)定時(shí)，下一步是選擇一種適當(dāng)?shù)姆稚?。重要的是，所選擇的分散劑對(duì)于激光束是透明的，能確?？蛇M(jìn)行光散射測(cè)量；有不同于待測(cè)顆粒的折射率，因?yàn)樗^測(cè)到的散射強(qiáng)度取決于折射率的差別；在測(cè)定過(guò)程中不溶解被測(cè)物質(zhì)；能潤(rùn)濕被測(cè)顆粒，能確保聚集物分散；能穩(wěn)定分散后的顆粒，例如不發(fā)生再聚集；不是太黏稠，否則在測(cè)定過(guò)程中會(huì)形成氣泡。

在濕法測(cè)定過(guò)程中，分散的第一步是用所選的分散劑潤(rùn)濕顆粒表面。在某些情況下，可能有必要使用表面活性劑引起潤(rùn)濕。表面活性劑的作用是降低分散劑的表面張力。從而減小分散劑與顆粒表面的接觸角，有助于分散。表面活性劑的選擇取決于顆粒表面化學(xué)和分散劑的性質(zhì)。

在SOP開發(fā)過(guò)程中，重要的是要考慮樣品量和分散裝置設(shè)置對(duì)于粒徑測(cè)定的影響。必須確定用于濕法激光衍射測(cè)量的樣品濃度，以便獲得可重現(xiàn)的散射數(shù)據(jù)，而不出現(xiàn)多重散射。

激光衍射法是通過(guò)測(cè)量激光束穿過(guò)被分散的顆粒樣品時(shí)散射光角度的不同對(duì)粒度分布進(jìn)行測(cè)定。是使用米氏光散射理論，對(duì)角度散射光強(qiáng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算形成散射圖樣的顆粒粒度。因此受諸多因素影響，例如：折射率、分散劑種類及用量、分散效果等等因素影響。因此，常用圖像分析方法與激光衍射法進(jìn)行比較，確定后者是否能夠反映樣品的真實(shí)粒度分布情況。

本研究建立了微粉化環(huán)索奈德激光粒度測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、耐用性好，可用于微粉化環(huán)索奈德中間體控制的質(zhì)量評(píng)價(jià)，為環(huán)索奈德微粉化工藝參數(shù)摸索提供評(píng)價(jià)手段，同時(shí)為本品制劑的產(chǎn)品開發(fā)提供研究基礎(chǔ)，從而達(dá)到質(zhì)量可控的目的。