唐立成 吳宏宇,2 黃青山,*

(1 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳學(xué)研究所遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433；2 上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司，上海 201206)

近年來，抗生素濫用導(dǎo)致多重耐藥菌出現(xiàn)頻率大幅提高，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，因此迫切需要尋找抗生素的合適替代品[1]?？股甘且活惪梢允怪虏∥⑸锼劳龅拿福钤绫欢x為通過降解細(xì)菌細(xì)胞壁從而具有抗菌能力的噬菌體裂解酶[2]，現(xiàn)在一般也將細(xì)菌素、自溶素和溶菌酶[3]包含在內(nèi)。CHAP抗生酶是一類含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶。CHAP結(jié)構(gòu)域(CHAP domain)是屬于抗生酶催化域中的一種，與其他抗生酶催化域不同的是，它是一類半胱氨酸、組氨酸依賴性的酰胺水解酶或肽酶(cysteine,histidine-dependent amidohydrolases/peptidases,CHAP)，一般由110～140個(gè)氨基酸組成，在親核攻擊機(jī)制中利用催化半胱氨酸殘基發(fā)揮催化活性作用[4]。CHAP結(jié)構(gòu)域由于普遍擁有優(yōu)異的抑菌活性[5]，被應(yīng)用于新型嵌合體抗菌酶的設(shè)計(jì)和改造，并且取得了眾多研究成果[6-7]。目前已有一些含CHAP結(jié)構(gòu)域抗生酶的報(bào)道，并且對其結(jié)構(gòu)和功能也有了不少研究，例如LysGH15的CHAP結(jié)構(gòu)域首次被確證為是一個(gè)EF-hand-like鈣結(jié)合蛋白[8]；通過為PlyTW的CHAP結(jié)構(gòu)域添加SH3b結(jié)合域可以增加CHAP結(jié)構(gòu)域活性[9]等。

相對于已有大量數(shù)據(jù)庫研究的抗菌肽來說，目前抗生酶數(shù)據(jù)庫僅有EnzyBase[10]，phiBIOTICS[11]和GMEnzy[12]3個(gè)數(shù)據(jù)庫。它們均未對抗生酶中的CHAP抗生酶進(jìn)行系統(tǒng)分析，所收集的CHAP抗生酶數(shù)據(jù)較少甚至沒有。為此，本課題從權(quán)威數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表的科學(xué)文獻(xiàn)中收集了1572條含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶，對這些抗生酶進(jìn)行了詳細(xì)注釋和分類，包括蛋白質(zhì)名稱、來源、抗菌活性數(shù)據(jù)、CHAP結(jié)構(gòu)域長度、結(jié)構(gòu)和抗菌活性等信息，并建立了基于Web的數(shù)據(jù)庫，可以直接從瀏覽器訪問和檢索所有數(shù)據(jù)。這些信息不僅可以用作已報(bào)道的含有CHAP結(jié)構(gòu)域抗生酶之間的比較，也可以對新型CHAP結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析。

1 材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

首先通過關(guān)鍵詞("CHAP","enzybiotic","lysin","lysozyme")檢索PubMed中包含CHAP抗生酶實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)，然后從文獻(xiàn)中抽取CHAP抗生酶信息，同時(shí)對UniProtKB蛋白數(shù)據(jù)庫檢索CHAP結(jié)構(gòu)域蛋白，得到初步的CHAP抗生酶數(shù)據(jù)，共計(jì)6416條，留作數(shù)據(jù)整理。

1.2 數(shù)據(jù)整理與數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)

對手動收集的文獻(xiàn)與數(shù)據(jù)庫中的CHAP抗生酶信息進(jìn)行數(shù)據(jù)整合，刪除冗余與不確定信息，參考對應(yīng)的文獻(xiàn)與數(shù)據(jù)庫，最終本研究獲得了1572條含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶。對這些CHAP抗生酶進(jìn)行信息關(guān)聯(lián)和信息注釋，信息來源于UniProtKB、InterPro、PDB和GO等公共數(shù)據(jù)庫。同時(shí)根據(jù)收集到的CHAP抗生酶蛋白序列，運(yùn)用BioPerl程序包計(jì)算CHAP抗生酶的物化性質(zhì)參數(shù)，包括序列長度、分子量、電荷量、pI值等信息。整理后的CHAP抗生酶信息主要包含基本信息、活性信息、序列信息、結(jié)構(gòu)信息和文獻(xiàn)信息。據(jù)此進(jìn)行對應(yīng)的關(guān)系表設(shè)計(jì)，并在MySQL數(shù)據(jù)庫中將其實(shí)現(xiàn)。目前數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)收集的截止日期為2018年5月30日。

1.3 Web接口與功能開發(fā)

CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫構(gòu)建在一個(gè)運(yùn)行WAMP架構(gòu)的64位的Windows (2008 R2)虛擬服務(wù)器上。服務(wù)器整合了Apache HTTP Server (V2.4.23) Web服務(wù)器和PHP (V5.4.45)以及MySQL Server (V5.5.20)數(shù)據(jù)庫服務(wù)器。所有數(shù)據(jù)保存在MySQL數(shù)據(jù)庫中。服務(wù)器端程序主要使用PHP語言編寫，部分功能使用Perl語言編寫，通過PHP進(jìn)行功能調(diào)用。前端使用jQuery JavaScript Library (V1.6.2)和Highchart jQuery插件以及Cascading Style Sheets (CSS)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。Apache、MySQL、PHP、Perl和jQuery都是開源軟件且都是平臺獨(dú)立的技術(shù)，非常適合用于學(xué)術(shù)研究。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 CHAP抗生酶數(shù)據(jù)收集與整理結(jié)果

從數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)信息中收集了1572條CHAP抗生酶，包含1394條來自251種細(xì)菌的CHAP抗生酶和178個(gè)來自12種噬菌體的抗生酶。數(shù)據(jù)庫對CHAP抗生酶的基本信息、活性信息、序列信息、結(jié)構(gòu)信息和文獻(xiàn)信息進(jìn)行了詳細(xì)描述?；拘畔⒅饕瑏碓?、功能、物化性質(zhì)、數(shù)據(jù)庫鏈接等，結(jié)構(gòu)信息包含結(jié)構(gòu)域信息和三維結(jié)構(gòu)信息。

2.2 數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)結(jié)果

當(dāng)前CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫主要由5個(gè)MySql關(guān)系表組成，分別是Chap、Sequence、Activity、Reference、Domain和Dom2Go表，這些表之間的關(guān)系如圖1所示。Chap表主要保存CHAP抗生酶的基本信息，其中Reference表保存Chap抗生酶相關(guān)的文獻(xiàn)信息，Sequence表和Activity表分別保存CHAP抗生酶的蛋白序列信息和抗菌活性信息，此外，Domain表存儲CHAP抗生酶的結(jié)構(gòu)域信息，而衍生出的Dom2Go表則是保存結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的GO注釋信息。從關(guān)系表模式圖(圖1)可以清晰了解整個(gè)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)架。

圖1 CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫關(guān)系表模式圖Fig.1 Schema of the CHAP enzybiotic database

2.3 數(shù)據(jù)庫Web接口

數(shù)據(jù)庫Web接口如圖2所示。接口主要包含瀏覽(Browse)、搜索(Search)、統(tǒng)計(jì)信息(Statistical Info) 和指南(Guide)。通過瀏覽接口用戶可以瀏覽數(shù)據(jù)庫的所有CHAP抗生酶數(shù)據(jù)，并且可以在此頁面下載FASTA格式的所有CHAP抗生酶數(shù)據(jù)，方便用戶進(jìn)行獨(dú)立的數(shù)據(jù)分析和設(shè)計(jì)研究。搜索接口主要包含快速搜索和高級搜索。用戶可以使用關(guān)鍵詞進(jìn)行快速搜索，也可以利用高級搜索功能針對蛋白名稱、來源和靶向目標(biāo)等進(jìn)行單一或者組合搜索。數(shù)據(jù)庫提供了數(shù)據(jù)查詢功能，瀏覽和搜索結(jié)果顯示的條目可以對應(yīng)數(shù)據(jù)庫中的每個(gè)CHAP抗生酶，每個(gè)CHAP抗生酶都有唯一的數(shù)據(jù)庫ID，點(diǎn)擊ID可以鏈接到這一CHAP抗生酶的詳情頁面(圖2)，在詳細(xì)信息中記錄了該抗生酶的基本信息、結(jié)構(gòu)域信息、GO注釋信息、3D結(jié)構(gòu)信息、序列信息、活性信息和文獻(xiàn)信息。同時(shí)還提供了評論接口供用戶對其進(jìn)行注釋和交流。

圖2 CHAP數(shù)據(jù)庫Web接口截圖Fig.2 Web interfaces of CHAP enzybiotic database

2.4 數(shù)據(jù)庫中信息分析

2.4.1 抗生酶來源統(tǒng)計(jì)

CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫收集了1572條CHAP抗生酶，其中1394條CHAP抗生酶來自251種細(xì)菌。細(xì)菌來源統(tǒng)計(jì)如圖3所示，排名前5的細(xì)菌來源占數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的36.3%(570/1572)。其中大部分來自于革蘭陽性菌鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和乳球菌屬(Lactococcus)，占數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的27.3%(429/1572)。來自于革蘭陰性菌的CHAP抗生酶主要來自于雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和埃希菌屬(Escherichia)，占數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的9.0%(141/1572)。

對178個(gè)來自12種噬菌體的CHAP抗生酶產(chǎn)生的噬菌體種屬的統(tǒng)計(jì)(圖4)發(fā)現(xiàn)，CHAP抗生酶主要來自于葡萄球菌噬菌體(Staphylococcusphage)，占數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的8.8%(139/1572)，其次是鏈球菌噬菌體(Streptococcusphage)，占數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的1.5%(24/1572)。

2.4.2 活性統(tǒng)計(jì)

對活性數(shù)據(jù)的分析表明，CHAP抗生酶主要對革蘭陽性菌有活性，包括葡萄球菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬等。對革蘭陰性菌也有活性，包括軍團(tuán)菌屬、銅綠假單胞菌屬和沙門菌屬等。

圖3 CHAP抗生酶的細(xì)菌來源Fig.3 Bacterial source of CHAP enzybiotics

圖4 CHAP抗生酶的噬菌體來源Fig.4 Bacteriophage source of CHAP enzybiotics

2.4.3 物化性質(zhì)統(tǒng)計(jì)

本數(shù)據(jù)庫中的CHAP抗生酶的序列在43～1819個(gè)氨基酸長度，最短的CHAP抗生酶SLE-1僅僅有43個(gè)氨基酸，僅有1個(gè)CHAP結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，而最長的CHAP抗生酶Antireceptor有1819個(gè)氨基酸，來自于鏈球菌噬菌體，由2個(gè)催化域組成。大部分(1330/1572,84.6%)的CHAP抗生酶分子量介于20～80kDa之間(圖5)，與抗菌肽相比，分子量相對還是較大的。對CHAP抗生酶等電點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)分析(圖6)顯示，數(shù)據(jù)庫中絕大多數(shù)(1344/1572,85.5%)CHAP抗生酶等電點(diǎn)位于4～11之間，同時(shí)也有2個(gè)CHAP抗生酶的等電點(diǎn)特別低(＜1)，4個(gè)特別高(＞13)，是否具有特別的意義，值得深入研究。

3 結(jié)論和討論

圖5 CHAP抗生酶的分子量分布Fig.5 Distribution of molecular weight for the CHAP enzybiotics

圖6 CHAP抗生酶的等電點(diǎn)分布Fig.6 Distribution of isoelectric points for the CHAP enzybiotics

隨著細(xì)菌耐藥問題的日益嚴(yán)峻，尋找具有全新作用機(jī)制的抗菌物質(zhì)顯得十分重要。抗生酶和抗菌肽就是其中比較重要的兩種。當(dāng)前國內(nèi)外已經(jīng)有多種抗生酶和抗菌肽在進(jìn)行治療耐藥菌感染相關(guān)的臨床試驗(yàn)[13-14]。國內(nèi)上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司開發(fā)的用于治療燒傷創(chuàng)面金黃色葡萄球菌感染的溶葡萄球菌酶涂劑已經(jīng)完成III期臨床試驗(yàn)[15]。建立相關(guān)的抗生酶數(shù)據(jù)庫有助于推動此領(lǐng)域的研究，開發(fā)更多的抗生酶用于耐藥菌感染的治療。

目前，針對抗菌肽已建立了非常多的數(shù)據(jù)庫，例如APD[16-18]、ANTIMIC[19]、AMPer[20]、CAMP[21-22]、DAMPD[23]、YADAMP[24]、LAMP[25]、BaAMPS[26]和DRAMP[27]。它們含有許多來自不同來源或特定家族的抗菌肽序列，對抗菌肽的研究提供了巨大的幫助。但對抗生酶進(jìn)行數(shù)據(jù)庫分類則相對較少，僅有2012年的EnzyBase[10]、2013年的phiBIOTICS[11]和2014年的GMEnzy數(shù)據(jù)庫[12]。其中phiBIOTICS是一個(gè)僅針對治療性抗生酶的數(shù)據(jù)庫，只有29個(gè)抗生酶及其69項(xiàng)相關(guān)研究信息，數(shù)據(jù)相對較少；EnzyBase最后更新于2012年，收錄了216種來源的1144種抗生酶。GMEnzy收集了157種遺傳修飾的抗生酶。與這些數(shù)據(jù)庫相比，本研究構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫重點(diǎn)研究含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶，針對含有這一類獨(dú)有結(jié)構(gòu)的抗生酶進(jìn)行系統(tǒng)分析整理。其它抗生酶數(shù)據(jù)庫均未對CHAP結(jié)構(gòu)域這一廣泛存在于抗生酶中的活性結(jié)構(gòu)域進(jìn)行描述和分析，本數(shù)據(jù)庫收錄了目前已有報(bào)道的含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶信息。

CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫可以幫助科研人員探索CHAP抗生酶的使用和設(shè)計(jì)新的抗生酶。通過數(shù)據(jù)庫，可以對所有含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶進(jìn)行進(jìn)化分析，了解不同抗生酶的進(jìn)化關(guān)系，對CHAP結(jié)構(gòu)域的差異性和共同性以及它們的抗菌活性的關(guān)系研究有著重要的意義。建立數(shù)據(jù)庫可以將目前零散的含有CHAP結(jié)構(gòu)域的抗生酶的研究系統(tǒng)化，用戶可以迅速地查找相關(guān)的理化性質(zhì)并進(jìn)行比較，可以快速找到針對一類或多類特定病原體的CHAP抗生酶，并對它們的活性和作用條件進(jìn)行篩選。并且本文的數(shù)據(jù)庫也可以為目前熱門的嵌合體抗生酶[28]的研究提供極大的幫助。通過比較和篩選針對特定病原菌的CHAP結(jié)構(gòu)域，可以為研究人員構(gòu)建嵌合體抗生酶提供新的思路。CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建將增加研究這些生物活性蛋白的效率和便利性。

對于潛在藥物來說，活性與毒性信息同樣重要。目前本文的CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫，活性數(shù)據(jù)并不全面，并且沒有包含細(xì)胞毒性的相關(guān)數(shù)據(jù)。在未來的工作中，本文將專注于收集完善CHAP抗生酶的活性數(shù)據(jù)以及細(xì)胞毒性信息，將數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步整合更新，以便更準(zhǔn)確地對CHAP抗生酶進(jìn)行評估。另外，由于目前關(guān)于CHAP抗生酶的結(jié)構(gòu)研究較少，結(jié)構(gòu)信息非常缺乏，我們計(jì)劃將一些結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析工具整合入數(shù)據(jù)庫中，以便研究者更好地利用CHAP抗生酶數(shù)據(jù)庫進(jìn)行CHAP抗生酶設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)功能領(lǐng)域的探索。

致謝：上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司對本研究工作的支持。