朱傳柳 趙士明 章小同 李新慧 彭文博

(江蘇久吾高科技股份有限公司，南京 210061)

棒酸(clavulanic acid)，又稱(chēng)克拉維酸，是由棒酸鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)產(chǎn)生的一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑[1-2]。棒酸具有抗菌能力弱、抑酶能力強(qiáng)的特點(diǎn)，因?yàn)槠浔旧韮H有微弱的抗菌活性，但對(duì)各種β-內(nèi)酰胺酶有強(qiáng)抑制作用，可與β-內(nèi)酰胺酶牢固結(jié)合，生成不可逆的結(jié)合物，具有強(qiáng)力而廣譜的抑制β-內(nèi)酰胺酶的作用[3-4]。此外，棒酸與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素合用起協(xié)同作用，單獨(dú)應(yīng)用無(wú)效，常與青霉素類(lèi)藥物合用治療葡萄球菌屬或革蘭陰性菌所致的疾病[5-6]。

傳統(tǒng)棒酸發(fā)酵液的澄清方法主要采用板框壓濾和萃取，該提純方法的缺點(diǎn)是板框過(guò)濾的自動(dòng)化程度低，人工成本高，且板框處理后的濾液仍含有較多可溶性蛋白；萃取過(guò)程中易發(fā)生乳化現(xiàn)象，且萃取需要消耗大量溶媒，設(shè)備投資高、運(yùn)行成本高，收率較低[7-9]。隨著膜技術(shù)的發(fā)展，膜分離技術(shù)以其特有的優(yōu)勢(shì)將不同粒徑大小的物質(zhì)進(jìn)行分離，已經(jīng)在發(fā)酵液提取分離領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[10-11]。如今棒酸的生產(chǎn)工藝(圖1)就主要采用膜集成工藝進(jìn)行澄清，即“50nm陶瓷膜和有機(jī)膜(1～3萬(wàn)分子量)”過(guò)濾澄清。該方法不僅大大減少了溶劑的使用，降低了廢水處理的投資，還提高了產(chǎn)品的收率和品質(zhì)[8,12]。但該澄清方法中有機(jī)膜的使用壽命較短(正常情況下只能使用1年)，投資成本較高，不適合大規(guī)模的應(yīng)用。

近年來(lái)，隨著膜技術(shù)的快速發(fā)展，更小孔徑的新型陶瓷膜研發(fā)成功，如1、2、4、5、8、10和20nm等，且在氨基酸、蔗糖、抗生素等已大規(guī)模應(yīng)用[13-15]?；诖耍疚臄M采用新型孔徑陶瓷膜對(duì)棒酸發(fā)酵液進(jìn)行一步陶瓷膜法澄清研究，取代“50nm陶瓷膜和有機(jī)膜(1～3萬(wàn)分子量)”過(guò)濾澄清方法，從而簡(jiǎn)化棒酸生產(chǎn)工藝流程、降低生產(chǎn)成本和運(yùn)行成本，從而提高產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力和行業(yè)的技術(shù)水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棒酸發(fā)酵液：山東某棒酸生產(chǎn)公司提供；磷酸氫二鈉(色譜純)、甲醇(色譜純)等：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；棒酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司。

圖1 目前棒酸的生產(chǎn)工藝Fig.1 Current production process of clavulanic acid

1.2 設(shè)備與儀器

陶瓷膜設(shè)備(膜元件：孔徑分別為4、5、8、10、50nm 19通道的膜管，膜管長(zhǎng)度1016mm；膜組件：?jiǎn)沃そM件，面積0.2～0.3m2)：由江蘇久吾高科技股份有限公司自制；Agilent 1100液相色譜儀：美國(guó)Agilent科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)方法

(1)膜集成工藝法澄清：取發(fā)酵好的棒酸發(fā)酵液100L，調(diào)pH至5.0～5.5，將其送入50nm陶瓷膜進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾的溫度控制在10～14℃，過(guò)濾壓力為0.25Mpa，濃縮至1.6倍后，開(kāi)始加入軟化水洗濾，加水量為原液體積的2.5～3.0BV，得到陶瓷膜滲透液。

然后將得到的陶瓷膜滲透液送入有機(jī)超濾膜過(guò)濾裝置進(jìn)一步除雜，有機(jī)膜截留分子量為10000Da，過(guò)濾的溫度控制在10～14℃，過(guò)濾壓力為0.4Mpa，循環(huán)流量為1.5m3/h。最后獲得有機(jī)膜滲透液。并用相關(guān)檢測(cè)方法分別檢測(cè)發(fā)酵液、陶瓷膜滲透液和有機(jī)膜滲透液中的棒酸含量以及蛋白含量等。

(2)一步陶瓷膜法澄清：取發(fā)酵好的棒酸發(fā)酵液100L，調(diào)pH至5.0～5.5，將其分別送入孔徑為4、5、8和10nm陶瓷膜進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾的溫度控制在10～14℃，過(guò)濾壓力為0.4Mpa，濃縮至1.6倍后，開(kāi)始加入軟化水洗濾，加水量為原液體積的2.5～3.0BV，得到陶瓷膜滲透液。并用相關(guān)檢測(cè)方法分別檢測(cè)發(fā)酵液、陶瓷膜滲透液中的棒酸含量以及蛋白含量等。

(3)陶瓷膜操作參數(shù)的優(yōu)化：①操作壓力的優(yōu)化：取50kg棒酸發(fā)酵液置于陶瓷膜設(shè)備中，設(shè)定操作壓力分別為3.5、4.0和4.5bar，膜面流速4m/s，溫度10～14℃，陶瓷膜濃縮1.6倍，加2.5BV純水連續(xù)洗濾菌液，考察操作壓力對(duì)陶瓷膜過(guò)濾通量的影響。

②膜面流速的優(yōu)化：取50kg棒酸發(fā)酵液置于陶瓷膜設(shè)備中，設(shè)定膜面流速分別在3、4和5m/s，控制操作壓力0.4MPa，溫度10～14℃，陶瓷膜濃縮1.6倍，加2.5BV純水連續(xù)洗濾菌液，考察膜面流速對(duì)陶瓷膜過(guò)濾通量的影響。

③濃縮倍數(shù)與洗水倍數(shù)的優(yōu)化：取50kg棒酸發(fā)酵液置于陶瓷膜設(shè)備中，首先控制濃縮倍數(shù)分別為1.5、1.6、1.65和1.7倍，再分別加原液的2.5BV純水洗濾菌液，考察陶瓷膜濃縮倍數(shù)對(duì)陶瓷膜過(guò)濾通量和收率的影響；其次控制濃縮倍數(shù)為1.65倍，再加原液的2.5、2.7和3.0BV的純水洗濾，考察洗水倍數(shù)對(duì)陶瓷膜過(guò)濾通量和收率的影響。

1.3.2 分析方法

(1)棒酸效價(jià)的測(cè)定：采用高效液相色譜法測(cè)定，詳細(xì)步驟如文獻(xiàn)[8]所示。

(2)蛋白含量測(cè)定：采用凱氏定氮法測(cè)定，詳細(xì)步驟如文獻(xiàn)[16]所示。

(3)棒酸截留率的測(cè)定：在膜分離過(guò)程中，待陶瓷膜設(shè)備穩(wěn)定運(yùn)行10min以后，取某一時(shí)刻的瞬時(shí)清液和濃液，再測(cè)定瞬時(shí)清液和濃液中的棒酸含量，按下述公式計(jì)算棒酸的截留率：

式中，c為棒酸的截留率(%)；w2為陶瓷膜透過(guò)液中棒酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；w1為濃縮液中棒酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

(4)陶瓷膜通量的測(cè)定[14,17-18]：設(shè)備穩(wěn)定運(yùn)行后，測(cè)定陶瓷膜過(guò)濾過(guò)程中某一時(shí)間點(diǎn)的通量情況，即計(jì)算出單位時(shí)間、單位膜面積滲透液出來(lái)的體積，計(jì)算方法如下：J=V/(S×t)。

式中，J為通量，單位：L/(m2·h)；V為t時(shí)間內(nèi)滲透水的體積，單位：L；S為膜面積，單位：m2；t為測(cè)量的時(shí)間，單位：h。

2 結(jié)果與討論

2.1 新型孔徑陶瓷膜的澄清效果

根據(jù)棒酸的性質(zhì)，以及分子量等，選擇4、5、8和10nm 4支新型孔徑陶瓷膜進(jìn)行過(guò)濾分離，分別比較膜過(guò)濾通量、除雜效果，以及收率，確定較優(yōu)孔徑的陶瓷膜。

2.1.1 膜過(guò)濾通量的比較

由于陶瓷膜孔徑的差異，其膜過(guò)濾通量和滲透液質(zhì)量也存在一定的差異。因而在相同條件下(溫度10～14℃，P=3.5bar，膜面流速=4m/s)，處理同一批次棒酸發(fā)酵液，4種不同新型孔徑的陶瓷膜(4、5、8和10nm)的過(guò)濾通量如圖2所示。

由圖2可知，4和5nm陶瓷膜過(guò)濾通量較低；10nm陶瓷膜起始通量?jī)?yōu)于8nm陶瓷膜，但是后期通量衰減較快，下降較明顯。這可能是由于后期發(fā)酵液濃度較高，膜表面濃差極化更加嚴(yán)重，發(fā)酵液中的雜質(zhì)分子粒徑與10nm陶瓷膜孔徑大小較接近，更容易堵膜，導(dǎo)致10nm陶瓷膜通量降低較快。8nm陶瓷膜的過(guò)濾通量最優(yōu)，平均通量可達(dá)57kg/(m2·h)。綜上，就過(guò)濾通量而言，8nm陶瓷膜更加適合棒酸發(fā)酵液的澄清。

圖2 不同孔徑陶瓷膜的通量隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)Fig.2 Flux of different pore size ceramic membranes over time

2.1.2 除雜效果和收率的比較

由于陶瓷膜孔徑大小的不同，因而對(duì)棒酸發(fā)酵液的除雜效果、棒酸的截留率也不相同。4種不同新型孔徑的陶瓷膜過(guò)濾后清液的效果由表1所示。

從表中可以看出，4和5nm陶瓷膜過(guò)濾后的清液雜質(zhì)較少、質(zhì)量較好，但是這兩種陶瓷膜對(duì)棒酸的截留率較高，分別有24.6%和20.1%，會(huì)導(dǎo)致收率很低，因而不適合進(jìn)行棒酸發(fā)酵液的過(guò)濾。8和10nm陶瓷膜對(duì)棒酸也有截留，但是截留率很低，當(dāng)后期向發(fā)酵液中加入原體積3.0BV的純水洗濾時(shí)，該部分被截留的棒酸也會(huì)慢慢被洗出來(lái)。而且8nm陶瓷膜過(guò)濾后的清液質(zhì)量明顯優(yōu)于10nm陶瓷膜。因此，相對(duì)來(lái)說(shuō)，8nm陶瓷膜的除雜效果和收率更佳。

2.2 陶瓷膜工藝優(yōu)化

由“2.1”項(xiàng)可知，8nm陶瓷膜更適合棒酸發(fā)酵液的除雜澄清，因而本節(jié)進(jìn)一步通過(guò)調(diào)控操作參數(shù)(操作壓力、膜面流速、濃縮倍數(shù)等)，優(yōu)化陶瓷膜過(guò)濾，提高膜過(guò)濾通量和棒酸收率。

2.2.1 操作壓力的優(yōu)化

膜過(guò)濾過(guò)程是以壓力為驅(qū)動(dòng)力的分離過(guò)程，一般情況下，隨著壓力的提高，滲透液出來(lái)的速度也會(huì)加快；但同時(shí)濃差極化現(xiàn)象也會(huì)更加嚴(yán)重，易導(dǎo)致膜層被堵，使膜過(guò)濾通量降低。因此，合適的操作壓力對(duì)膜過(guò)濾通量有著至關(guān)重要的作用[18]。8nm陶瓷膜在不同操作壓力下的過(guò)濾通量由圖3所示。

表1 不同孔徑陶瓷膜過(guò)濾清液的對(duì)比Tab.1 Comparison of different aperture ceramic membranes filtrate

由圖3可知，不同跨膜壓力差下，8nm陶瓷膜過(guò)濾的通量變化趨勢(shì)相對(duì)一致，都是先逐漸下降，然后保持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的通量過(guò)濾。3種操作壓力(3.5、4.0和4.5bar)下，各自平均過(guò)濾通量分別為52、60和61kg/(m2·h)。4.0和4.5bar的操作壓力下，膜平均過(guò)濾通量相近；但壓力越高，能耗越大。因此，選擇操作壓力為4.0bar時(shí)過(guò)濾棒酸發(fā)酵液更為合適。

圖3 不同操作壓力對(duì)陶瓷膜的通量的影響Fig.3 Effect of different operating pressures on the flux of ceramic membrane

2.2.2 膜面流速的優(yōu)化

其他操作參數(shù)不變，控制膜面流速分別為3、4和5m/s時(shí)，考察陶瓷膜滲透液通量變化，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同膜面流速對(duì)陶瓷膜過(guò)濾通量的影響Fig.4 Effect of different membrane flow velocity on filtration flux of ceramic membrane

當(dāng)把膜面流速?gòu)?m/s提到4m/s時(shí)，通量有所上升；但繼續(xù)提高至5m/s時(shí)，通量變化不大。因此，一開(kāi)始膜面流速提高有利于增大料液與膜之間的剪切力，從而減緩膜污染的速度；但膜面流速較大時(shí)，不僅耗能大，且易產(chǎn)生泡沫而影響體系的穩(wěn)定性[18]。因而，膜面流速為4m/s時(shí)，過(guò)濾棒酸發(fā)酵液較合適。

2.2.3 濃縮倍數(shù)和洗水倍數(shù)的優(yōu)化

一般情況下，處理相同體積的料液，濃縮倍數(shù)越高，過(guò)濾后剩余的濃液就越少；需要加水洗濾時(shí)，所需的清洗加水量就越小，過(guò)濾時(shí)間就越短。但是另一方面，隨著料液逐漸濃縮，總固形物將增大，料液通量會(huì)逐漸下降，過(guò)濾時(shí)間將大大延長(zhǎng)[19]。因此，需要找到最佳濃縮點(diǎn)，來(lái)保證過(guò)濾時(shí)間較短，收率較高。因而將棒酸發(fā)酵液使用8nm陶瓷膜過(guò)濾，溫度控制在10～14℃，膜面流速4m/s，濃縮至一定倍數(shù)后開(kāi)始加水連續(xù)洗濾，以每次2L的洗水量控制洗水的進(jìn)出速度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 濃縮倍數(shù)、洗水倍數(shù)與收率的關(guān)系Tab.2 The relationship between the yield and the multiple of concentration and the multiple of washing water

由表2可知，隨著濃縮倍數(shù)的提高，當(dāng)加入等體積的水洗濾時(shí)，收率逐漸提高，但膜過(guò)濾平均通量逐漸降低；綜合考慮收率和過(guò)濾時(shí)間，將濃縮倍數(shù)定在1.65倍時(shí)，開(kāi)始加水洗濾較為合適。此外，當(dāng)濃縮倍數(shù)一定時(shí)，隨著加水量的增大，收率也逐漸上升；綜合考慮收率和成本，加水洗濾3.0BV時(shí)效果較佳，收率可達(dá)97.5%。

綜上，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，棒酸發(fā)酵液在溫度10～14℃、濃縮1.65倍、加水洗濾3.0BV效果較佳，膜過(guò)濾通量可達(dá)62L/(m2·h)，比優(yōu)化前提高了10.7%；收率為97.5%，提高了2.5個(gè)百分點(diǎn)。

2.3 一步膜法工藝與膜集成工藝的對(duì)比

目前，大多數(shù)棒酸生產(chǎn)廠家均采用膜集成工藝澄清棒酸發(fā)酵液。因而將一步膜法澄清的新工藝與膜集成工藝就清液質(zhì)量、棒酸收率和成本進(jìn)行比較，其結(jié)果如表3所示。

由表3可知，8nm陶瓷膜處理后的清液與膜集成工藝處理后的清液質(zhì)量相比，膜集成技術(shù)法稍?xún)?yōu)，但不明顯；當(dāng)后期添加原液的3.0BV純水洗濾時(shí)，兩種技術(shù)處理后最終得到的混合清液的效果基本一致。表中的澄清成本是指處理一噸的棒酸發(fā)酵液兩種澄清方式所需要大概的人工費(fèi)、設(shè)備費(fèi)、水電費(fèi)等總費(fèi)用。由表3可知，膜集成工藝的澄清成本明顯高于一步8nm陶瓷膜澄清法。此外，一步8nm陶瓷膜法澄清相比于膜集成工藝，其運(yùn)行成本(人工費(fèi)+水電費(fèi)+設(shè)備折舊維修等)降低了約2倍，投資成本降低了約1.6倍(減少了一套有機(jī)膜設(shè)備)，收率還提高了約2.5%。而且8nm陶瓷膜一步處理法已經(jīng)完成中試，并成功得到合格的產(chǎn)品。因而，一步陶瓷膜法可替代目前的膜集成工藝法澄清技術(shù)，不僅簡(jiǎn)化了棒酸生產(chǎn)工藝流程，還提高了收率，降低了投資成本和運(yùn)行成本。

表3 一步膜法工藝與膜集成工藝的比較Tab.3 Comparison of one-step membrane process and membrane integration process

2.4 陶瓷膜的清洗

棒酸發(fā)酵液中含有較多的培養(yǎng)基原料、菌絲體以及蛋白質(zhì)等，在進(jìn)行陶瓷膜過(guò)濾時(shí)，與膜孔徑大小相近的雜質(zhì)會(huì)進(jìn)入膜孔內(nèi)部，造成膜孔堵塞，影響膜的過(guò)濾性能[14,18,20]。因此，每批次陶瓷膜過(guò)濾實(shí)驗(yàn)完成后，都要停機(jī)進(jìn)行膜的清洗、再生以恢復(fù)膜元件的過(guò)濾性能。

針對(duì)棒酸發(fā)酵液體系，通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)考察，清洗方法如下：首先可用水沖刷，去除管道和膜表面的可逆污染；再配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%的NaOH、0.5%～1.0%NaClO在60℃以上清洗1h，去除難分解的污染物；再用水沖洗至中性，如此水通量每次恢復(fù)率可達(dá)98%以上。

3 結(jié)論

3.1 新型孔徑陶瓷膜的選擇以及陶瓷膜工藝的優(yōu)化

通過(guò)比較，8nm陶瓷膜較優(yōu)；在溫度10～14℃、濃縮1.65倍、加水洗濾3.0BV效果較佳，膜過(guò)濾通量可達(dá)62L/(m2·h)，比優(yōu)化前提高了10.7%；收率為97.5%，提高了2.5%。

3.2 一步新型孔徑陶瓷膜法與膜集成工藝法澄清效果的對(duì)比

一步8nm陶瓷膜法澄清效果與之相近，但運(yùn)行成本降低了2倍，投資成本降低了1.6倍，收率還提高了約2.5%。

3.3 陶瓷膜的再生

采用常規(guī)的清洗方法，陶瓷膜的水通量即可恢復(fù)，再生性較好。