楊柳 劉建華 張智潔 劉勇 秦曉松

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院檢驗科，沈陽 110004)

肺炎克雷伯菌是寄居于人體呼吸道及腸道的條件致病菌，為革蘭陰性腸桿菌科細(xì)菌，常造成嚴(yán)重的院內(nèi)感染，如敗血癥、尿路感染、腹腔內(nèi)感染等。隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。碳青霉烯類抗生素，即亞胺培南、美羅培南等，具有抗菌活性強、抗菌譜廣、對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)穩(wěn)定等特點，常用來治療多重耐藥肺炎克雷伯菌導(dǎo)致的嚴(yán)重感染。然而，自從碳青霉烯酶的發(fā)現(xiàn)，使這些細(xì)菌對幾乎除了替加環(huán)素(tigecycline,TIG)及多黏菌素外的所有抗生素高度耐藥，因此，替加環(huán)素引起了學(xué)者的高度重視，被認(rèn)為是治療耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae,CRKP)感染的最后一道防線[1]。

替加環(huán)素是為抵抗四環(huán)素類抗生素耐藥而對米諾環(huán)素進(jìn)行修飾而成的衍生物，是一種新型的甘氨酰環(huán)素類抗生素。2005年，美國食品與藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)替加環(huán)素治療復(fù)雜的腹腔感染、復(fù)雜的皮膚和軟組織感染以及社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎[2]。2012年在我國批準(zhǔn)上市。但目前，我國所采用的美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)中尚無替加環(huán)素的體外藥敏試驗的操作指南及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，并且替加環(huán)素的理化性質(zhì)不穩(wěn)定，進(jìn)行體外藥敏試驗時對環(huán)境要求較高，因此，臨床實驗室常采用的藥敏方法在對替加環(huán)素耐藥性評估方面往往會出現(xiàn)偏差。為了向臨床合理應(yīng)用替加環(huán)素治療CRKP感染提供可靠的依據(jù)，評價替加環(huán)素對CRKP不同體外藥敏試驗的方法學(xué)尤為重要。

本研究共收集遼寧省內(nèi)多家大型三甲醫(yī)院分離的CRKP 269株，分別采用微量肉湯稀釋法、KB紙片擴散法、Vitek-2儀器法及E試驗法檢測其對替加環(huán)素的耐藥表型，比較檢測結(jié)果的差異性，對不同體外藥敏試驗的方法學(xué)進(jìn)行評價，且本研究首次對國產(chǎn)藥敏紙片及E試驗藥敏試驗條進(jìn)行評估，旨在初步了解遼寧地區(qū)CRKP對替加環(huán)素的耐藥情況，更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)貫榕R床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集遼寧省多家大型三甲醫(yī)院自2011年1月—2016年12月住院患者非重復(fù)CRKP共269株，其中中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院41株、遼寧省人民醫(yī)院144株、大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院38株、大連市中心醫(yī)院20株、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院10株、中國人民解放軍第202醫(yī)院9株、遼陽市中心醫(yī)院5株、本溪市中心醫(yī)院1株、遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院1株。在受試菌株中，46.5%(125/269)來源于重癥監(jiān)護(hù)病房，11.2%(31/269)來源于呼吸內(nèi)科，9.7%(26/269)來源于急診科，5.2%(14/269)來源于神經(jīng)外科，4.8%(13/269)來源于神經(jīng)內(nèi)科。受試菌株標(biāo)本類型包括：痰液66.9%(180/269)，血液11.9%(32/269)，尿液7.1%(19/269)，其他14.1%(38/269)。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 儀器與試劑

Vitek-2全自動細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀及革蘭陰性細(xì)菌藥物敏感性卡AST-N335(法國Bio-Merieux公司)，替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(Toronto Research Chemicals)，替加環(huán)素藥敏紙片及替加環(huán)素E試驗法藥敏試驗條(溫州市康泰生物科技有限公司)，M-H肉湯(英國Oxoid公司)，MH瓊脂培養(yǎng)基(沈陽彥程生物制品有限公司)。紙片擴散法、E-試驗法及微量肉湯稀釋法所用M-H瓊脂或96孔板均需置于37℃恒溫孵箱，避光培養(yǎng)16～18h后讀取藥敏結(jié)果，判讀實驗結(jié)果時質(zhì)控菌株ATCC25922抑菌圈直徑范圍應(yīng)為20～27mm，MIC值范圍應(yīng)為0.0～0.25μg/mL以證明在控[3]。

1.3 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

本研究參照FDA腸桿菌科標(biāo)準(zhǔn)及歐洲藥敏試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)標(biāo)準(zhǔn)[4-5]對結(jié)果進(jìn)行判讀(表1)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以微量肉湯稀釋法為金標(biāo)準(zhǔn)，比較KB紙片擴散法、Vitek-2儀器法及E試驗法的一致性?；疽恢侣?essential agreement,EA)：被評估方法所得MIC值與金標(biāo)準(zhǔn)MIC值相同或者相差±1個稀釋度的菌株百分比。分類一致率(categorical agreement,CA)：被評估方法藥敏試驗結(jié)果(敏感、中介、耐藥)與金標(biāo)準(zhǔn)一致的菌株百分比。小誤差(minor error,mE)：被評估方法將中介判定為敏感或耐藥。大誤差(major error,ME)：被評估方法將敏感判定為耐藥。重大誤差(very major error,VME)：被評估方法將耐藥判定為敏感。根據(jù)CLSI要求，可接受誤差范圍為：EA和CA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%[6]。

2 結(jié)果

2.1 4種藥敏試驗方法測定CRKP對替加環(huán)素的敏感性分布

269株CRKP經(jīng)微量肉湯稀釋法測得替加環(huán)素MIC50和MIC90分別為0.5和1μg/mL，E試驗法的MIC50和MIC90較微量肉湯稀釋法均低1個稀釋度(0.25和0.5μg/mL)，而Vitek-2法的MIC90較微量肉湯稀釋法高出2個稀釋度。按照FDA及EUCAST判定標(biāo)準(zhǔn)，E試驗法敏感率最高，分別為100%(269/269)、98.9%(266/269)；Vitek-2法耐藥率最高，分別為8.6%(23/269)、13.4%(36/269)；紙片擴散法的中介率最高，分別為11.9%(32/269)、46.5%(125/269)。4種藥敏試驗方法測定CRKP對替加環(huán)素的敏感性分布見表2。

表1 替加環(huán)素對肺炎克雷伯菌藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Interpretation criteria of tigecycline for Klebsiella pneumoniae

2.2 3種方法與微量肉湯稀釋法檢測結(jié)果比較

以微量肉湯稀釋法為參考方法，E試驗法的EA為90.0%(242/269)，多數(shù)菌株MIC值較微量肉湯稀釋法低1～2個稀釋度。按FDA判定標(biāo)準(zhǔn)，E試驗法的CA最高，為97.4%(262/269)，Vitek-2法和紙片擴散法的CA較低，分別為87.4%(235/269)、85.9%(231/269)，但均未出現(xiàn)VME。Vitek-2法的EA較低，為61.7%(166/269)且ME最高，為6.3%(17/269)。按EUCAST判定標(biāo)準(zhǔn)，E試驗法CA仍最高，為92.9%(250/269)，而紙片擴散法CA最低，僅為46.5%(125/269)。E試驗法VME最高，為1.9%(5/269)，E試驗法、Vitek-2法、紙片擴散法的ME分別為0%(0/269)、7.4%(20/269)、5.6%(15/269)，見表3。

微量肉湯稀釋法測定替加環(huán)素MIC＜2μg/mL的CRKP，即較敏感的菌株共251株，E試驗法測得絕大多數(shù)MIC值與微量肉湯稀釋法相同或相差±1個稀釋度，MIC值低于微量肉湯稀釋法2個稀釋度的占5.6%(14/251)；Vitek-2法測得大多數(shù)MIC值高于微量肉湯稀釋法，其中高于微量肉湯稀釋法1～3個稀釋度的分別占40.2%(101/251)、27.5%(69/251)和10.4%(26/251)。微量肉湯稀釋法測定替加環(huán)素MIC≥2μg/mL的CRKP，即較耐藥的菌株共18株，E試驗法測得所有結(jié)果均低于微量肉湯稀釋法，其中低于微量肉湯稀釋法1～4個稀釋度的分別占33.3%(6/18)、50%(9/18)、11.1%(2/18)和5.6%(1/18)；Vitek-2法測大多數(shù)MIC值高于微量肉湯稀釋法，其中高于微量肉湯稀釋法1～2個稀釋度的分別占33.3%(6/18)和44.4%(8/18)，見表4。

表2 4種藥敏試驗方法測定CRKP對替加環(huán)素的敏感性分布[%(株)]Tab.2 Comparison of interpretative results and MIC50 and MIC90 of CRKP to tigecycline by susceptibility testing methods [%(No.)]

表3 E試驗法、Vitek-2法、紙片擴散法與微量肉湯稀釋法檢測結(jié)果比較[%(株)]Tab.3 Incidence of errors for selected testing methods [%(No.)]

表4 E試驗法、Vitek-2法與微量肉湯稀釋法MIC值比較[%(株)]Tab.4 Comparison of MIC values between E-test method,Vitek-2 method and broth microdilution method [%(No.)]

3 討論

目前，由CRKP引起的感染的治療并未標(biāo)準(zhǔn)化，且通常取決于臨床微生物學(xué)實驗室提供的藥敏試驗結(jié)果。替加環(huán)素越來越多地應(yīng)用于這些感染的治療，評估其對CRKP的抗菌活性十分重要，因此，確保臨床常用藥敏試驗方法的準(zhǔn)確性是尤為必要的。

本研究中，微量肉湯稀釋法結(jié)果顯示，替加環(huán)素對CRKP保持較高的抗菌活性，MIC50和MIC90分別為0.5和1μg/mL；E試驗法的敏感率最高，為100%/98.9%(FDA/EUCAST判定標(biāo)準(zhǔn))，且無耐藥菌株產(chǎn)生，此法較微量肉湯稀釋法MIC值普遍低1～2個稀釋度；Vitek-2法的耐藥率最高，為8.6%/13.4%(FDA/EUCAST判定標(biāo)準(zhǔn))，多數(shù)菌株檢測MIC結(jié)果明顯高于微量肉湯稀釋法，此結(jié)果與相關(guān)研究報道相符[7-8]。紙片擴散法的中介率和耐藥率都較高，分別為11.9%/46.5%和2.6%/10%(FDA/EUCAST判定標(biāo)準(zhǔn))。

E試驗法、Vitek-2法、紙片擴散法與微量肉湯稀釋法檢測結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，E試驗法的EA與CA均符合CLSI標(biāo)準(zhǔn)，即大于90%，無ME，但存在VME，可能是由于E試驗法所測MIC值稀釋度普遍低于微量肉湯稀釋法，尤其是耐藥性較高的CRKP，出現(xiàn)VME的可能性更大。Vitek-2法為國內(nèi)微生物實驗室常用的藥敏檢測方法，但本研究結(jié)果顯示，其EA與CA均較低，EA僅為61.7%，顯著低于CLSI參考標(biāo)準(zhǔn)，無VME，但ME較高，為6.3%/7.4%(FDA/EUCAST判定標(biāo)準(zhǔn))。類似的研究報道表明[9]，Vitek-2法適合檢測對替加環(huán)素敏感的大腸埃希菌，但對MIC＞2μg/mL的菌株，Vitek-2法測得的替加環(huán)素的敏感率會顯著低于微量肉湯稀釋法。紙片擴散法的CA最低，為85.9%/46.5%(FDA/EUCAST判定標(biāo)準(zhǔn))，按FDA標(biāo)準(zhǔn)，紙片擴散法的mE、ME均在參考范圍內(nèi)，且無VME。但紙片擴散法易受多種因素影響，如預(yù)溫育時間、接種菌含量、抗生素含量及其擴散能力、瓊脂厚度、紙片保存條件等等，因此，此法仍需大量臨床樣本加以驗證。

微量肉湯稀釋法測得MIC值≥2μg/mL的CRKP共18株，其中E試驗法經(jīng)反復(fù)復(fù)核后，測得MIC值低于微量肉湯稀釋法1～4個稀釋度的分別占33.3%(6/18)、50%(9/18)、11.1%(2/18)和5.6%(1/18)，而微量肉湯稀釋法測得MIC值＜2μg/mL的251株CRKP中，絕大部分菌株E試驗法測得的MIC值相同或降低1個稀釋度?？梢姡瑢τ谀退幮栽礁叩腃RKP，E試驗法與微量肉湯稀釋法的一致性越低，VME較高，對臨床用藥的指導(dǎo)意義也隨之減低；而微量肉湯稀釋法測得MIC值≥2μg/mL的18株CRKP中，Vitek-2法測定MIC值中≥8μg/mL的CRKP高達(dá)14株，對于微量肉湯稀釋法測得MIC值為1μg/mL的25株CRKP中，Vitek-2法測定仍有14株MIC值≥4μg/mL?？梢?，對于敏感性越高的CRKP，Vitek-2法所測結(jié)果與微量肉湯稀釋法的一致性越低，ME較高，而對于非敏感的CRKP，Vitek-2法與微量肉湯稀釋法的一致性較高?？傊愃蒲芯客瑯涌砂l(fā)現(xiàn)當(dāng)微量肉湯稀釋法測得CRKP敏感率較高時，E試驗法與微量肉湯稀釋法的一致性較高[10]；當(dāng)微量肉湯稀釋法測得CRKP耐藥率較高時，Vitek-2法的結(jié)果與微量肉湯稀釋法一致性較高[11]。因此，微生物實驗室應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)測醫(yī)院及地區(qū)的耐藥趨勢，必要時采用微量肉湯稀釋法進(jìn)一步確認(rèn)。

綜上所述，微量肉湯稀釋法是目前被認(rèn)為檢測替加環(huán)素體外藥物敏感性的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但操作較繁瑣且對藥物及培養(yǎng)基等要求較高，我國已有明確的替加環(huán)素體外藥敏試驗的專家共識[2]，操作時應(yīng)嚴(yán)格遵照執(zhí)行；紙片擴散法測定結(jié)果錯誤率較高，并不適合單獨用于臨床樣本檢測；E試驗法雖然與微量肉湯稀釋法的一致性較高，但對于替加環(huán)素耐藥的CRKP，其測定MIC值顯著偏低，可見，國產(chǎn)藥敏紙片及E試驗條均需要進(jìn)一步驗證；Vitek-2法ME較高，其測定MIC值顯著高于微量肉湯稀釋法。因此，CRKP對替加環(huán)素耐藥性檢測的幾種常用藥敏試驗方法均有其局限性，可考慮聯(lián)合檢測，對于結(jié)果不一致的情況，均應(yīng)參考微量肉湯稀釋法。

本次研究收集了遼寧省內(nèi)多家大型三甲醫(yī)院的CRKP，藥敏試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)CRKP對替加環(huán)素仍保持較高的敏感性，可見，替加環(huán)素對于臨床治療CRKP感染仍是一個重要的手段。