仲玉鑫 ，胡珊 ，王婷婷 ，張雨淼 ，李萬(wàn)忠 ，于麗 ，劉雨清 ，張紅霞 *

（濰坊醫(yī)學(xué)院1臨床醫(yī)學(xué)院臨床病理學(xué)系，2神經(jīng)疾病與再生修復(fù)實(shí)驗(yàn)室，3組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，4附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，5藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，濰坊 261053）

香椿子是楝科植物香椿干燥成熟的果實(shí)，主要成分有黃酮、多元酚、倍半萜烯等，具有抗腫瘤、降糖、抗炎、抗氧化等[1-4]多種作用。香椿子石油醚提取物能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激改善DN（diabetic nephropathy, DN）大鼠的腎臟損傷[2]。香椿子提取物對(duì)不同腎臟細(xì)胞的具體作用及機(jī)制，尚不清楚。

腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（glomerular endothelial cells，GEC）是有窗孔的特殊內(nèi)皮細(xì)胞，被覆一層200～400nm厚的多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，與腎小球?yàn)V過(guò)功能有關(guān)系。近年來(lái)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞逐漸成為糖尿病腎病研究的熱點(diǎn)，高糖引起的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的重要因素[5-7]。本研究中，我們主要研究香椿子正丁醇提取物能否改善高糖引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激并探討可能的機(jī)制。

材料與方法

1 主要試劑

兔抗Nrf2購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；鼠抗HO-1、NQO1、p47phox購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；鼠抗GAPDH購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；硝酸還原酶法一氧化氮（NO）試劑盒購(gòu)自南京建成；活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；香椿子正丁醇提取物（n-butyl alcohol extract ofToona sinensis，NBAE）由濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。

2 人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（human renal glomerular endothelial cells, HRGEC, 購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司）于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱（95%O2，5%CO2）中，用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代，取3～10代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將HRGEC以適當(dāng)密度接種，單層細(xì)胞密度達(dá)到80%后分為4組：空白組、高糖組（HG組，25mmol/L D-葡萄糖）、HG+NBAE組（培養(yǎng)基為不完全培養(yǎng)基與NBAE大鼠血清的混合物，二者之比為9:1），培養(yǎng)24h后觀察。

3 DCFDA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總ROS

將細(xì)胞接種入6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至適當(dāng)密度，按照上面實(shí)驗(yàn)分組中所述方法作用24h后棄去原培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入終濃度為2μmol/L的DCFHDA液2ml，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育30min，無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，于熒光顯微鏡下直接觀察并拍攝圖片，用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析平均光密度以表示細(xì)胞內(nèi) ROS 的含量。

4 Nitrate/Nitrite Colorimetric法檢測(cè)NO含量

實(shí)驗(yàn)分組與2相同，取各組細(xì)胞上清液，采用硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量，詳細(xì)操作按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。NO 含量值按照說(shuō)明書(shū)給出的公式計(jì)算：

5 Western blot

將HRGEC進(jìn)行相應(yīng)處理24h后，裂解細(xì)胞提取其總蛋白質(zhì)行8% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用3% 脫脂奶粉+2% BSA室溫下封閉2h，分別加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日TBST洗滌3次后加二抗室溫孵育1h，再次TBST洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，X線膠片曝光，采用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)各條帶灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶吸光度與內(nèi)參照GAPDH條帶吸光度的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

6 免疫熒光染色

用 PBS 洗滌細(xì)胞2次，5% 多聚甲醛固定5min，PBS 洗3次每次5min；1% 羊血清封閉 15min；稀釋適量比例的一抗（陰性對(duì)照用 PBS 代替一抗）孵育過(guò)夜，PBS 洗3次每次5min；1:200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1:200稀釋的TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG） 孵育 30min，PBS 洗3次每次5min；Hoechst33342常溫下孵育5min染核，PBS 洗2次每次3min；含熒光淬滅劑的封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 不同處理組之間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NBAE降低人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞高糖誘導(dǎo)的ROS水平

DCFDA法檢測(cè)ROS結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，HG組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增高（圖1、圖2）。與HG組相比，HG+NBAE組細(xì)胞ROS水平明顯下降，NBAE明顯降低高糖誘導(dǎo)的ROS水平（圖1、圖2）。此結(jié)果表明，高糖刺激可誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生，而NBAE可抑制氧化應(yīng)激，降低ROS水平。

圖1 高糖和NBAE對(duì)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響的DCFDA法檢測(cè)。A，Ctrl組；B，HG組；C，HG+NBAE組；比例尺，50μm Fig. 1 Effect of high glucose and NBAE on ROS level in the glomerular endothelial cells detected by DCFDA method. A, Ctrl group； B, HG group； C,HG+NBAE group； scale bar, 50μm

圖2 高糖和/或NBAE對(duì)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響的定量分析。A, Ctrl組ROS水平 B, HG組ROS水平 C, HG+NBAE組ROS水平 D, 不同處理組ROS水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；***P＜0.001，與Ctrl組相比；#0.01＜P＜0.05與HG組相比，n=3Fig 2. Quantitative analysis for effect of high glucose and/or NBAE on ROS level in the glomerular endothelial cells. A, Ctrl group ROS level； B, HG group ROS level； C, HG+NBAE group ROS level； D, statistic analysis of ROS level in different treatment groups； ***P＜0.001, compared with Ctrl group； #0.01＜P＜0.05, compared with HG group, n=3

2 NBAE抑制人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞高糖導(dǎo)致的p47phox表達(dá)增高

P47phox是NADPH氧化酶的一個(gè)催化亞單位，主要位于胞質(zhì)內(nèi)，其表達(dá)增加可以上調(diào)NADPH氧化酶活性[8,9]，故抑制p47phox表達(dá)能夠降低NADPH氧化酶的表達(dá)，從而減輕氧化應(yīng)激。免疫熒光染色顯示，p47phox細(xì)胞內(nèi)的分布主要在細(xì)胞質(zhì)中；與Ctrl組相比，HG組中p47phox在胞質(zhì)內(nèi)平均光密度值顯著增高（圖3B），且p47phox的表達(dá)增高主要聚集在細(xì)胞一側(cè)（圖3A）；與HG組相比，HG+NBAE組中p47phox在胞質(zhì)平均光密度值明顯降低，并且減輕高糖導(dǎo)致的局部表達(dá)增高，使p47phox在胞質(zhì)中均勻表達(dá)（圖3B）。結(jié)果表明高濃度葡萄糖能夠刺激 p47phox 在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)量增高，NBAE能夠抑制高濃度葡萄糖所致的p47phox的表達(dá)上調(diào)。

圖3 高糖和/或NBAE對(duì)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)p47phox水平和分布影響的免疫熒光檢測(cè)。A, p47phox免疫熒光染色（比例尺，20μm）與p47phox免疫反應(yīng)性的定量檢測(cè)；B, p47phox免疫反應(yīng)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與Ctrl組相比，*0.01＜P＜0.05；與HG組相比，#0.01＜P＜0.05；n=3Fig. 3 Immunofluorescence detection for effect of high glucose and / or NBAE on the level and distribution of p47phox in the glomerular endothelial cells. A, imunofluorescence staining of p47phox (scale bar, 20μm) and quantitation of p47phox immunoreactivity； B, statistical analysis of p47phox immunoreactivity； *0.01＜P＜0.05, compared with Ctrl group； #0.01＜P＜0.05 compared with HG group； n=3

3 NBAE部分阻抑人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)高糖所致的NO水平降低

Nitrate/Nitrite Colorimetric法檢測(cè)NO結(jié)果顯示，空白組NO含量為77.19±11.43μmol/L，HG組NO水平較Ctrl組明顯降低，約降低一半；HG+NBAE組NO水平較HG組升高（表1），表明NBAE能在一定程度上抑制人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)高糖所致的NO水平降低。

表1 高糖和/或NBAE處理人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中NO水平比較Tab. 1 Comparison of NO levels in the glomerular endothelial cells treated with high glucose and/or NBAE

4 NBAE對(duì)高糖誘導(dǎo)的Nrf2通路活性的影響

免疫熒光染色顯示，在空白對(duì)照組可見(jiàn)Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中均勻表達(dá)；在HG組和HG+NBAE處理組中，Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)，說(shuō)明高糖、NBAE能夠刺激Nrf2向核內(nèi)易位。Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，HG組Nrf2水平和Nrf2的下游蛋白NQO1與HO-1水平降低（圖4）；與HG組相比，HG+NBAE處理組的Nrf2水平顯著增加（圖4）；隨著Nrf2的激活，NQO1和HO-1也被激活，與HG組相比，HG+NBAE處理組的NQO1和HO-1水平也顯著升高（圖4）。

圖4 高糖和/或NBAE對(duì)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1及HO-1水平的影響。A，免疫熒光染色檢測(cè)Nrf2水平和定位變化（比例尺，20μm）；B, Western blot 分別檢測(cè)Nrf2、NQO1及HO-1水平變化，GAPDH為內(nèi)參照；C, Nrf2、NQO1及HO-1水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*0.01＜P＜0.05，與 Ctrl組相比；與 HG 組相比：#0.01＜P＜0.05，##P＜0.01；n=3Fig.4 Effects of high glucose and / or NBAE on Nrf2, NQO1 and HO-1 levels in the glomerular endothelial cells. A, detection for level and localization of Nrf2 by immunofluorescence (scale bar, 20μm)； B, detection of Nrf2, NQO1 and HO-1 levels by Western blot, GAPDH was used as internal reference；C, statistical analysis of Nrf2, NQO1 and HO-1 levels； *0.01＜P＜0.05, compared with control group； #P＜0.05, ##P＜0.01, compared with HG group； n=3

討 論

糖尿病腎病中，高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂成為誘發(fā)糖尿病微血管并發(fā)癥的首要步驟[10]，可以通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成增多，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高[11]。抑制氧化應(yīng)激，可以改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能。如熱休克蛋白22（HSP22）通過(guò)減少線粒體活性氧產(chǎn)生抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化和血管病變從而保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）免受高糖誘導(dǎo)的損傷[12]。

香椿子具有多種藥用價(jià)值，民間常用香椿子泡水或煎服，具有改善DN的功效。也有學(xué)者研究證實(shí)香椿子提取物可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激保護(hù)糖尿病腎臟[13]，我們進(jìn)一步研究香椿子正丁醇提取物能否通過(guò)影響腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞改善糖尿病病變程度。ROS容易對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞特別是具有豐富毛細(xì)血管的器官造成不同程度的損傷。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖處理24 h后腎小球內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平升高，使用NBAE處理后ROS水平明顯降低。P47phox是NADPH氧化酶的一個(gè)催化亞單位，主要位于胞質(zhì)內(nèi)，一旦激活就會(huì)易位到胞膜上[14]，從而使NADPH氧化酶激活，誘導(dǎo)過(guò)氧化物生成，因而是氧化應(yīng)激的一種標(biāo)志物。有研究報(bào)道，NADPH氧化酶亞基p47phox亦可通過(guò)增加其表達(dá)量來(lái)上調(diào)NADPH氧化酶活性，如，葫蘆巴丸可抑制糖尿病大鼠體內(nèi)NADPH氧化酶上游調(diào)控因子C-α蛋白激酶(PKC-α) 與NADPH 氧化酶亞單位p47phox蛋白及mRNA的表達(dá)，降低腎臟組織NOX活性, 并減輕對(duì)腎臟組織的氧化應(yīng)激損傷[15]。黃芪湯能夠有效降低NADPH氧化酶水平及其亞基p47phox、p67phox、p40phox等的表達(dá)，以降低ROS的表達(dá)，改善同型半胱氨酸（Hcy）誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙[16]。本研究發(fā)現(xiàn)高糖刺激24h后p47phox在胞質(zhì)熒光強(qiáng)度明顯提高，且熒光增強(qiáng)主要位于細(xì)胞一側(cè)，連同局部胞膜表達(dá)量增高，分析原因可能是：原位于胞質(zhì)低表達(dá)的p47phox經(jīng)高糖刺激后，表達(dá)量增高并在細(xì)胞內(nèi)聚集然后向胞膜轉(zhuǎn)移，故有局部表達(dá)增高，至于在細(xì)胞一側(cè)的聚集原因還需要進(jìn)一步的研究。本研究還觀察到NBAE可降低高糖引起的p47phox在胞質(zhì)的高表達(dá)。一氧化氮（NO）是最重要的內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管舒縮因子之一，具有松弛血管平滑肌、舒張血管、預(yù)防凝血及血小板聚集等作用。NO在組織中的合成和降解維持一種動(dòng)態(tài)平衡，ROS可迅速滅活NO，正常生理?xiàng)l件下，NO合成與ROS降解之間維持動(dòng)態(tài)平衡，在高糖刺激時(shí)，產(chǎn)生大量ROS，可以破壞動(dòng)態(tài)平衡，造成NO迅速減少。本研究結(jié)果亦證實(shí)，高糖刺激后腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞NO水平明顯降低，而NBAE可部分恢復(fù)NO的水平。以上結(jié)果表明高糖刺激腎小球內(nèi)皮細(xì)胞后引起氧化應(yīng)激，NBAE可以多方面改善高糖引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應(yīng)激損傷中通過(guò)上調(diào)下游抗氧化酶，如NQO1、HO-1等發(fā)揮調(diào)節(jié)保護(hù)作用。青藤堿通過(guò)激活Nrf2，然后抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路，減少ROS生成，從而改善高糖引起的腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[11]。高糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，桂皮醛通過(guò)激活Nrf2抑制ROS生成，維持NO水平保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，如果干擾Nrf2上述反應(yīng)消失[17]。這些研究表明激活Nrf2信號(hào)通路以減少氧化應(yīng)激是保護(hù)組織細(xì)胞的重要途徑。為了明確NBAE是否能通過(guò)激活Nrf2通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化作用，本研究繼而檢測(cè)了Nrf2的表達(dá)情況，Western blot結(jié)果表明，高糖處理組Nrf2表達(dá)下降，給與NBAE處理后， Nrf2表達(dá)水平明顯升高，核易位明顯增多，其下游蛋白NQO1和HO-1的表達(dá)亦明顯增多。以上結(jié)果表明，NBAE可能通過(guò)激活Nrf2通路以改善高糖引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激。

綜上所述，本研究表明NBAE可改善高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激，推測(cè)可能通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路減少ROS的生成、抑制NADPH氧化酶激活、維持NO水平等方面來(lái)實(shí)現(xiàn)。本文為探索香椿子正丁醇提取物改善糖尿病腎病提供了一定的理論基礎(chǔ)。