丁麗紅，方慶全，張翠霞

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廈門 361003）

冷凍切片是利用低溫條件快速將組織冷凍成具有一定硬度以切出薄片的過程[1]，近年來該技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用到術(shù)中病理診斷中[2-5]。術(shù)中冷凍切片病理診斷可以確定病變、了解惡性腫瘤的擴散情況、確定腫瘤部位的手術(shù)切緣是否有腫瘤組織殘留，因此，深受術(shù)中外科醫(yī)師的青睞。由于甲狀腺組織細(xì)胞豐富、血供豐富、常伴有囊腫[6]，其冷凍制片技術(shù)受多種因素的影響，如取材厚度、速凍方法、染色方法等，制作冰凍切片過程易出現(xiàn)裂隙、冰晶形成、膠質(zhì)脫落等現(xiàn)象，制片難度較大，易導(dǎo)致術(shù)中病理診斷困難[7]。為此，作者通過對比實驗，從甲狀腺組織冷凍切片的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，研究優(yōu)化方案，以期提高其制片質(zhì)量。

資料與方法

1 資料

收集我院病理科2018年1月至2018年12月接收的新鮮甲狀腺標(biāo)本，患者年齡22～70歲，平均年齡(38.7±10.6)歲。

2 主要設(shè)備

LEICA CM1950冷凍切片機（德國萊卡）；達科為自動染色機（達科為醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

3 試劑

冷凍切片專用包埋劑，AAF液(由乙酸、95%乙醇、甲醛按5：85：10的比例配制而成)， 新鮮配制的Harri蘇木素染液，1%鹽酸乙醇，0.5%酸化伊紅，75%、85%、95%、無水梯度乙醇，二甲苯。

4 制作“冰墊”托頭

制作方法同王玉環(huán)等介紹的方法[8]。取冷凍切片機配套托頭，加上約0.2 cm 厚的包埋劑后，置于冷凍切片機凍臺上進行速凍，包埋劑凍上后，用冷凍切片機將托頭上的包埋劑修平并修至余下約0.1cm厚，形成帶包埋劑墊的“冰墊”托頭，置于預(yù)先設(shè)置至-25℃的凍臺上備用。

5 冷凍切片制備

不同取材厚度條件下甲狀腺組織冷凍切片的制備：收集已行術(shù)中冷凍切片病理診斷后剩余的新鮮甲狀腺標(biāo)本40例，每例切取質(zhì)地相近、面積約為1.5cm×1cm的4塊組織，按取材厚度0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm分別編為A、B、C、D組，取出“冰墊”托頭，于室溫（＞20℃）回暖 3～4s 后，將甲狀腺組織放于“冰墊”托頭中部，加適量冷凍切片專用包埋劑，移至-25℃的冷凍切片機凍臺上速凍并于上方加蓋冷凍冰錘，甲狀腺組織凍成凍塊后，移至-17℃～-10℃的平臺上回暖30s，用夾頭設(shè)置為-17℃的冷凍切片機修至所需切面（盡量少修）后，切取所需切片（厚度為 6μm），立即放入固定液固定30s，取出切片置于達科為自動染色機內(nèi)染色，中性樹膠封固、顯微鏡觀察。甲狀腺組織冷凍切片制備流程如圖1。比較不同取材厚度對甲狀腺組織冷凍切片制片質(zhì)量的影響。

圖1 甲狀腺組織冷凍切片制備流程圖Fig. 1 Flow chart of preparation method of thyroid tissue frozen sections

不同速凍方法下甲狀腺組織冷凍切片的制備：取已行術(shù)中冷凍切片病理診斷后剩余的新鮮甲狀腺標(biāo)本40例，每例切取質(zhì)地相近、大小為 1.5cm×1cm×0.3cm 的甲狀腺組織5塊，隨機取其中1塊組織，按前述B組的方法進行冷凍切片制備（E組）；再隨機取另1塊組織，立即置于-25℃、未置于室溫回暖的“冰墊”托頭上速凍，余操作同B組（F組）；再隨機取1塊組織，將托頭連同組織放置于預(yù)先冷凍至-18℃的凍臺上進行速凍，余操作同B組（G組）；再隨機另取1塊組織，立即置于-25℃、未預(yù)先制作“冰墊”的托頭上速凍，余操作同B組（H組）；剩余的1塊組織，放置于無“冰墊”的常溫托頭上，加適量冷凍切片機專用包埋劑后，置于-25℃的凍臺上進行速凍，余操作同B組（I組）。比較5種不同速凍方法下甲狀腺組織冷凍切片制備過程中組織塊崩裂的發(fā)生率、速凍完成時間，及裂隙、冰晶及組織結(jié)構(gòu)清晰度 3項指標(biāo)的得分情況。

不同染色方法下甲狀腺冷凍切片的制備：收集已行術(shù)中冷凍切片病理診斷后剩余的新鮮甲狀腺標(biāo)本100例，按前述B組的方法取材、速凍、切片（連續(xù)切片2片）、固定，隨機取其中1片，按中華醫(yī)學(xué)會編著的《臨床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊》的操作步驟進行染色（J組）；另1片采用達科為自動染色機（每缸染色液的染色時間同J組）進行染色（K組）。比較 2種不同染色方法下甲狀腺冷凍切片的染色優(yōu)良率、染色效率等指標(biāo)。

6 冷凍切片質(zhì)量觀察指標(biāo)

切片有無裂隙、冰晶、組織結(jié)構(gòu)清晰3項評分各10分，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：若切片無裂隙、無冰晶、組織結(jié)構(gòu)清晰，則各得分為10分；若切片見少量裂隙、冰晶，組織結(jié)構(gòu)較不清晰，尚不影響觀察，減1～2分；若切片見多量裂隙、冰晶，組織結(jié)構(gòu)不清晰，一定程度的影響觀察，減3～6分；若切片見大量裂隙、冰晶，組織結(jié)構(gòu)模糊不清，嚴(yán)重影響觀察，減7～10分。得分結(jié)果采用ˉx±s表示。由2名質(zhì)控師對所有冷凍切片進行雙盲評片，每項指標(biāo)的得分為評分的均值。每項指標(biāo)的得分≥9分為優(yōu)，7.5～8.9分為良，6.0～7.4為基本合格，≤5.9分為不合格。

7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗，計量資料用ˉx±s表示，用配對t檢驗兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 取材厚度對甲狀腺組織冷凍切片制片質(zhì)量的影響

不同取材厚度條件下甲狀腺組織冷凍切片觀察有無裂隙與冰晶2項指標(biāo)評分結(jié)果。A、B 兩組無裂隙與無冰晶2項指標(biāo)得分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；B組無裂隙、無冰晶2項指標(biāo)得分高于C組與D組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（0.01＜P＜0.05）（表1）。可見，甲狀腺組織冷凍切片取材厚度以0.2～0.3cm 為佳（圖2）。

表1 甲狀腺冷凍切片不同取材厚度條件下無裂隙、無冰晶指標(biāo)得分Tab.1 No crack and no ice crystal index score of thyroid tissue frozen section with different thickness

圖2 取材厚度對甲狀腺組織冷凍切片的影響。a，B組，取材厚度0.3cm裂隙少、冰晶少；b，C組，取材厚度0.4cm裂隙較多、冰晶較多；c，D組，取材厚度0.5cm裂隙多、冰晶多；比例尺，100μmFig. 2 The effect of the thickness of material on the preparation for thyroid frozen section. a, group B, section with the thickness of 0.3cm had less cracks and ice crystals； b, group C, section with the thickness of 0.4cm had cracks and ice crystals； c, group D, section with the thickness of 0.5cm had more cracks and ice crystals； scale bar,100μm

2 速凍方法對甲狀腺組織冷凍切片質(zhì)量的影響

觀察不同速凍方法條件下甲狀腺組織冷凍切片無冰晶、無裂隙及組織結(jié)構(gòu)清晰情況。E、G、I 組未出現(xiàn)冷凍組織塊崩裂現(xiàn)象，F(xiàn) 組 15.0%（6/40）、H 組17.5%（7/40）出現(xiàn)冷凍組織塊崩裂現(xiàn)象，F(xiàn)、H 2組組織塊崩裂發(fā)生率均高于 E 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.50、5.64，0.01＜P＜0.05）。E、F、G、H、I 組平均速凍時間分別為 83.2±9.3s、82.5±9.6s、107.4±10.1s、86.7±7.8s、168.9±12.5s，E 組平均速凍時間顯著少于 G、I 組（P均＜0.01）；E、F、H 3組平均速凍時間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。E、F、H 3組無冰晶、無裂隙及組織結(jié)構(gòu)清晰3項指標(biāo)的得分組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；E組無冰晶、無裂隙及組織結(jié)構(gòu)清晰指標(biāo)3項的得分均高于G組與I 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（0.01＜P＜0.05）（表2）?？梢奅組的速凍方法最佳（圖3）。

3 染色方法對甲狀腺組織冷凍切片質(zhì)量的影響

J組的染色優(yōu)良率為94%（188/200），低于 K組的98%（196/200），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.17，0.01＜P＜0.05）。單臺冷凍切片染色時，J組染色時間為301.1±2.083s，K組為297.2±0.186s，兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.865，P＞0.05）。當(dāng)2份標(biāo)本同時送檢或2份標(biāo)本送檢時間相距＜2min，其切片需同時染色時，J組染色時間為556.9±1.714s，長于K組的495.1±0.1475s，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=35.92，P＜0.001）。可見，機染的甲狀腺組織冷凍切片質(zhì)量更佳。

討 論

1905年 Wilson Mecarty 將冷凍切片技術(shù)列為病理診斷方法之一［9］。冷凍切片可對術(shù)中病變組織做出精準(zhǔn)的診斷，可為外科醫(yī)師下一步的手術(shù)方案的制定提供依據(jù)，預(yù)防手術(shù)切除不足或過度切除[10]。

表2 甲狀腺不同速凍方法條件下冷凍切片3項指標(biāo)得分Tab.2 Three index scores of thyroid tissue frozen sections prepared by different quick freezing method

圖3 速凍方法對甲狀腺冷凍切片的影響。a，E組，預(yù)先制作“冰墊”托頭與甲狀腺組織置于-25℃的冷凍臺速凍并于上方加蓋冷凍冰錘，冰晶少、裂隙少、組織結(jié)構(gòu)清晰；b，G組，凍臺預(yù)先設(shè)置至－18℃，冰晶較多、裂隙較多、組織結(jié)構(gòu)較不清晰；c，I組，托頭常溫?zé)o“冰墊”，冰晶多、裂隙多、組織結(jié)構(gòu)較不清晰；比例尺，100μmFig. 3 The effect of quick freezing methods on thyroid tissue frozen section. a, group E, quick freezing by putting thyroid tissue with a pre-made “ice blanket” support at -25℃ cryostage, covered with a frozen ice hammer reduced ice crystals and fractures, improved clarity of tissue structure； b, group G, preset cryostage at -18℃ showed increased ice crystals and fractures, decreased clarity of tissue structure； c, group I, “blanket” at room temperature without ice showed more ice crystals and fractures, less clarity of tissue structure； scale bar,100μm

甲狀腺癌是目前臨床較為常見的一種甲狀腺惡性腫瘤，甲狀腺癌尤其是甲狀腺微小癌發(fā)生率呈逐年上升趨勢［11,12］，成為我國術(shù)中冷凍切片診斷中的主要疾病之一[13]。但甲狀腺組織細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)差異大，易發(fā)生誤診漏診，給病理醫(yī)師帶來很大的挑戰(zhàn)。冰凍切片質(zhì)量的好壞直接影響病理診斷準(zhǔn)確性。為減少誤診漏診率，提高病理診斷準(zhǔn)確性，優(yōu)化冰凍切片制作條件、保障冰凍切片質(zhì)量對臨床工作尤為重要。

甲狀腺組織冷凍切片的取材技術(shù)對其診斷具有至關(guān)重要的影響，尤其是含有甲狀腺微小乳頭狀癌的取材，如果腫瘤過小、或者取材醫(yī)師經(jīng)驗不足、或者取材困難時，容易發(fā)生漏診[14]。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在不影響診斷的前提下，冷凍切片取材應(yīng)盡量小一些，一般可切取1.5cm × 1.5cm × 0.3cm 大小，組織厚度勿超過4mm[15]。作者發(fā)現(xiàn)，甲狀腺新鮮組織行冷凍切片制備時，其取材厚度控制在0.2～0.3cm時，冷凍切片染色后觀察時出現(xiàn)裂隙或冰晶的現(xiàn)象很少，而當(dāng)取材厚度≥0.4cm時，由于在相同低溫條件下組織凍成凍塊的時間顯著延長，其冷凍切片染色片出現(xiàn)裂隙與/或冰晶的現(xiàn)象顯著增加，說明取材厚度以0.2～0.3cm為宜，增加取材厚度反而降低切片質(zhì)量。

在冷凍切片的制片過程中，應(yīng)盡量加快組織冷凍速度，使有害的冰晶縮小甚至無明顯影響[16,17]?？梢?，速凍是冷凍切片制備過程中至關(guān)重要的步驟之一[18，19]，速凍的目的是在較短時間內(nèi)應(yīng)用低溫條件快速將組織冷凍成硬塊，以便于后續(xù)的切片制備工作。F 組的“冰墊”托頭未于室溫中回暖即將組織塊放置于“冰墊”上，組織與“冰墊”粘附不牢固，容易崩裂；H組組織塊置于-25℃、未預(yù)先制作“冰墊”的托頭上進行速凍，組織與托頭上的“冰墊”粘附不牢固，后續(xù)切片時組織塊崩裂發(fā)生率達17.5%；G組用-18℃的凍臺進行速凍，I組組織放置于常溫?zé)o“冰墊”托頭上，再放入冷凍切片機凍臺上進行速凍，這兩組平均速凍速度均較E組慢，結(jié)果產(chǎn)生的冰晶與裂隙較多，組織結(jié)構(gòu)也較為不清晰，提示速凍時間延長會產(chǎn)生過多有害的冰晶，降低切片質(zhì)量。

冷凍切片傳統(tǒng)手工染色易受染液濃度、試劑溫度、染色時間長短、環(huán)境溫度、不同操作者的習(xí)慣等因素影響[20]，使細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色強度不穩(wěn)定，核質(zhì)對比不鮮明；而自動染色機可以設(shè)置統(tǒng)一的染色時間和程序，在做好質(zhì)控的前提下，可使每一批次的染色步驟與時間都能保持一致，染色后切片透明度好，紅藍分明，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對比清晰，而且省時省力[19]。在醫(yī)院病理科工作中，如果由一名技術(shù)員來承擔(dān)冷凍切片的制備工作，當(dāng)同時有多份標(biāo)本需要進行冷凍切片時，一名技術(shù)員很難在規(guī)定時間內(nèi)完成所有的冷凍切片制備工作，這時如果需要另一名技術(shù)員協(xié)助完成工作，就會顯著增加人力成本。如果使用自動染色機進行冷凍切片染色后，技術(shù)員可以統(tǒng)籌安排，前一例冷凍切片在染色機內(nèi)進行染色時，可以進行下一例冷凍切片的制備，然后再將切完、固定好的冰凍切片上機進行染色。這樣安排，一名技術(shù)員可以統(tǒng)籌處理同一時間段送檢的多份冷凍切片標(biāo)本，有效地控制完成冷凍切片的時間，這對及時完成多臺冷凍切片的制備，及時發(fā)送術(shù)中快速病理診斷報告、縮短臨床醫(yī)師手術(shù)等候時間、增加疾病控制率以及減少二次手術(shù)的風(fēng)險有著重要的意義。

在甲狀腺組織冷凍切片制備過程中，除了上述3項重要條件會對制片效率、切片質(zhì)量與染色效果造成不同程度的影響外，冷凍切片固定的及時性、固定液的選擇、固定時間的長短、切片方法等因素可能也會對制片質(zhì)量造成一定的影響，值得進一步的研究。

本研究結(jié)果表明，甲狀腺組織冷凍切片取材厚度以0.2～0.3 cm為佳；預(yù)先在冷凍切片托頭上制作厚約 0.1～0.2 cm的包埋劑凍成的“冰墊”，速凍甲狀腺組織前，取出“冰墊”托頭，于室溫中回暖 3～4 s 后，將甲狀腺組織置于帶“冰墊”托頭中部，加適量冷凍切片機專用包埋劑，移至-25℃的冷凍臺進行速凍并于上方加蓋冷凍冰錘為一種較佳的速凍方法；應(yīng)用自動染色機進行冷凍切片染色，其染色質(zhì)量優(yōu)良率、染色效率等指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)手工染色方法。采取以上優(yōu)化條件，可顯著提高甲狀腺組織冷凍切片的制片效率、切片質(zhì)量與染色效果，為術(shù)中病理診斷及手術(shù)方案的制定提供保障。