沈恒石，韓艷春, 張騫，馬莉，趙塞

（1沈陽(yáng)市第二中醫(yī)醫(yī)院病理科，沈陽(yáng) 110101；2濱州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，煙臺(tái) 264003）

乳腺癌是我國(guó)女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是我國(guó)女性癌癥死亡的首要原因。《2017中國(guó)癌癥報(bào)告》數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌為城市女性癌癥發(fā)病率之首，病死率占女性惡性腫瘤第7位，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌是乳腺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型。乳腺癌的發(fā)生與遺傳、免疫、激素及各種環(huán)境因素有關(guān)?？缒さ鞍?6A（transmembrane protein 16A，TMEM16A）在包括乳腺癌在內(nèi)多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，并與多種腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[1-3]。明確TMEM16A在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制將對(duì)乳腺癌的診斷及治療提供有利的線索。有報(bào)道認(rèn)為，敲除肝癌細(xì)胞中TMEM16A可降低p38磷酸化水平[4]，而TMEM16A和p-p38在乳腺癌中相關(guān)關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，我們分析了TMEM16A和p-p38在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)的臨床意義、TMEM16A 和p-p38之間的關(guān)系及其表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者預(yù)后的關(guān)系。

材料與方法

1 臨床資料

用于免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)的60例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織和相應(yīng)的距乳腺癌組織5cm以上的癌旁乳腺組織標(biāo)本收集于沈陽(yáng)市第二中醫(yī)醫(yī)院。所有病人均經(jīng)手術(shù)切除治療，術(shù)前未接受放療或化療等治療。根據(jù)所取標(biāo)本對(duì)應(yīng)住院號(hào)，提取所需各項(xiàng)臨床病理資料，包括患者性別、年齡、腫瘤最大直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、TMN分期等資料。所有患者均有完整的臨床、病理及隨訪資料，隨訪時(shí)間為30～80個(gè)月。其中所有組織標(biāo)本均來(lái)自女性患者；高分化程度者16例，中分化程度者28例，低分化程度者16例；TNM分期Ⅰ期者16例，Ⅱ期者24例，Ⅲ期者20例。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例。

2 試劑

TMEM16A和p-p38的兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；DAB顯色劑和免疫組織化學(xué)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3 免疫組織化學(xué)

自沈陽(yáng)市第二中醫(yī)醫(yī)院病理科收集來(lái)的乳腺組織蠟塊標(biāo)本均制成4μm厚的組織切片，采用免疫組織化學(xué)S-P法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色?？筎MEM16A（1: 200）、p-p38（1: 200）抗體均4℃ 孵育過(guò)夜。用PBS代替TMEM16A，p-p38抗體作為陰性對(duì)照，用已知呈陽(yáng)性染色的乳腺癌組織切片用來(lái)作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定：TMEM16A主要于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，p-p38主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，按著色細(xì)胞比例劃分為五個(gè)等級(jí)，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)分別為：無(wú)著色為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；而依據(jù)染色強(qiáng)度又劃分為四個(gè)等級(jí)，各級(jí)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)分別為：無(wú)染色者為0分，染為淡黃色者為1分，染為黃色或棕黃色者為2分，染為棕褐色者為3分。最后以著色細(xì)胞比例與染色強(qiáng)度之乘積所得分?jǐn)?shù)作為其最終得分，得分≥2定為陽(yáng)性表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Chi-Square檢驗(yàn)分析TMEM16A和p-p38分別與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系，用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行TMEM16A與p-p38的相關(guān)性分析，采用Kaplan-Meier進(jìn)行TMEM16A和p-p38分別與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者預(yù)后的分析，無(wú)復(fù)發(fā)生存率差異檢驗(yàn)采用log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

TMEM16A在胃腸道間質(zhì)瘤、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，并與多種腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[8-9]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TMEM16A在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)高于相應(yīng)癌旁乳腺組織中的表達(dá)，且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級(jí)低的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者組織中TMEM16A蛋白表達(dá)水平高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級(jí)高者，TMEM16A高表達(dá)的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存期低于TMEM16A低表達(dá)者的生存期。以上結(jié)果提示TMEM16A表達(dá)增強(qiáng)可能對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的惡變和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。

結(jié) 果

1 TMEM16A和p-p38在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)

TMEM16A和p-p38在60例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中均呈陽(yáng)性表達(dá)者28例，均呈陰性表達(dá)者12例；40例TMEM16A表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌浸潤(rùn)性導(dǎo)管組織中p-p38表達(dá)陽(yáng)性率為70%（28/40）；20例TMEM16A表達(dá)陰性的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中pp38表達(dá)陽(yáng)性率為40%（8/20）。經(jīng)Spearman相關(guān)分析得到：TMEM16A與p-p38在乳癌浸潤(rùn)性導(dǎo)管組織中存在正相關(guān)關(guān)系（表2）。

2 TMEM16A和p-p38與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的臨床病理特征的關(guān)系

對(duì)TMEM16A和p-p38表達(dá)分別與60例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的臨床病理特征的關(guān)系分析表明（表1），發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者組織中TMEM16A陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P=0.018），且TMEM16A陽(yáng)性表達(dá)亦與乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)有關(guān)（P=0.003)，而TMEM16A表達(dá)與乳腺癌患者的年齡、腫瘤的直徑和TNM分期差異沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高TNM分期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者組織中p-p38陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于低TNM分期和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P=0.019和P=0.004）；而p-p38表達(dá)與乳腺癌患者的年齡、腫瘤的直徑和組織學(xué)分級(jí)差異沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 TMEM16A在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及癌旁組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。A，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織；B，癌旁組織；比例尺，20μmFig. 1 Immunohistochemical examination for expression of TMEM16A in breast invasive ductal cancer and adjacent non-tumor tissues. A, breast invasive ductal cancer tissue； B, adjacent non-tumor colorectal tissues； scale bar, 20μm

圖2 p-p38在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及癌旁組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。A，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織；B，癌旁組織；比例尺，20μmFig. 2 Immunohistochemical examination for expression of p-p38 in breast invasive ductal cancer and adjacent non-tumor tissues. A, breast invasive ductal cancer tissue； B, adjacent non-tumor colorectal tissues； scale bar, 20μm

3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中TMEM16A與p-p38的表達(dá)呈正相關(guān)

通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了60對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織和相應(yīng)癌旁乳腺組織中TMEM16A和pp38的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中TMEM16A 主要于乳腺癌癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)陽(yáng)性率為66.7%（40/60），相應(yīng)癌旁乳腺組織中TMEM16A的表達(dá)陽(yáng)性率為13.3%（8/60）（圖1）。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中p-p38主要于乳腺癌癌細(xì)胞核內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)陽(yáng)性率為60%（36/60），而相應(yīng)癌旁乳腺組織中未見(jiàn)明顯pp38的陽(yáng)性表達(dá)（圖2）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，TMEM16A和p-p38在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)均高于癌旁乳腺組織中的表達(dá)（P＜0.01）。

4 TMEM16A和p-p38表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者預(yù)后的關(guān)系

計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)給人帶來(lái)方面的同時(shí)也隱藏著一些風(fēng)險(xiǎn)，清除計(jì)算機(jī)的潛在威脅對(duì)我國(guó)計(jì)算機(jī)安全網(wǎng)絡(luò)十分重要，因此，人們需要加強(qiáng)對(duì)這一領(lǐng)域的探索，正確地獲得較安全的網(wǎng)絡(luò)環(huán)境，促進(jìn)國(guó)家在信息時(shí)代的發(fā)展。實(shí)現(xiàn)向世界現(xiàn)今網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)看齊的重要意義。

對(duì)60例進(jìn)行乳腺癌手術(shù)患者進(jìn)行30～80個(gè)月的跟蹤隨訪。20例TMEM16A陰性表達(dá)者復(fù)發(fā)率為20%，40例TMEM16A陽(yáng)性表達(dá)者的復(fù)發(fā)率為62.5%；24例p-p38陰性表達(dá)者復(fù)發(fā)率為29.2%，36例p-p38陽(yáng)性表達(dá)者復(fù)發(fā)率為61.1%。繪制Kaplan-Meier無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)，結(jié)果表明TMEM16A、p-p38表達(dá)與術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存率呈負(fù)相關(guān)（分別log-rank=5.697、5.548，P=0.017、0.018）（圖3）。

討 論

離子通道的活動(dòng)是細(xì)胞增殖過(guò)程順利進(jìn)行的必備條件之一，與細(xì)胞增殖的關(guān)系成為目前研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。鈣激活氯離子通道（calcium-activated chloride channels, CaCCs）廣泛分布于人體的多種組織，尤其是分泌器官上皮細(xì)胞，與眾多病理生理過(guò)程密切相關(guān)[5]。TMEM16A是TMEM16膜蛋白家族成員之一，是鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ)。TMEM16A基因定位于人染色體11q13區(qū)域上，編碼的TMEM16A蛋白含有986個(gè)氨基酸[6]。有研究發(fā)現(xiàn)TMEM16A表達(dá)較高的腫瘤患者，其組織內(nèi) 11q13 染色體擴(kuò)增，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的誘導(dǎo)能力增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞更加具有侵襲性，腫瘤惡性潛能及惡性程度均更強(qiáng)［7］。目前對(duì)TMEM16A的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究及TMEM16A在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。

表1 TMEM16A和p-p38表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系Tab. 1 Correlation of TMEM16A and p-p38 expression with clinicopathological features of patients with breast cancer

表2 TMEM16A和p-p38表達(dá)的相關(guān)性分析Tab. 2 Correlation analysis of TMEM16A and p-p38 expression in the breast cancer

圖3 TMEM16A和p-p38表達(dá)與患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系Fig. 3 Correlation of TMEM16A and p-p38 expression with the recurrence-free survival rate of breast cancer

絕熱加速量熱儀的爐體受材質(zhì)約束,追蹤速度有一定范圍。在上述仿真中,為模擬真實(shí)樣品反應(yīng)過(guò)程,設(shè)定爐體的最大追蹤速率為0.67 K/s,顯然,在劇烈反應(yīng)階段樣品的反應(yīng)速率遠(yuǎn)大于爐體的最大追蹤能力,補(bǔ)償后樣品與爐體仍存在溫度差。若模型中去除限定條件,此時(shí)爐體追蹤能力接近于理想狀態(tài),樣品與爐體之間的溫差將趨近于0或很小,如圖5所示。

［3］覃子珍,龍映宏.面向?qū)ο蟪绦蛟O(shè)計(jì)課程翻轉(zhuǎn)課堂教學(xué)模式探索[J].計(jì)算機(jī)時(shí)代,2017(5):60-63.

MAPK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物過(guò)程，如凋亡、增殖、生長(zhǎng)和遷移，并在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。p38是MAPK家族重要成員，在多種因素的刺激下磷酸化而被激活，可促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[10]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，p-p38在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)高于相應(yīng)癌旁乳腺組織中的表達(dá)，且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高TNM分期的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者組織中p-p38蛋白表達(dá)水平高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低TNM分期者，p-p38高表達(dá)的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存期低于p-p38低表達(dá)者的生存期。以上結(jié)果提示p-p38表達(dá)增強(qiáng)可能對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的演進(jìn)和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。

雖然進(jìn)化是大勢(shì)所趨，但若一味聽(tīng)其自然無(wú)疑只能“緩步徐行”，而“革命”是以“人力的促進(jìn)”撤除進(jìn)化的障礙，加速進(jìn)化的過(guò)程，所以是很“經(jīng)濟(jì)”的手段。“經(jīng)濟(jì)”的時(shí)間觀意味著時(shí)間并非外在于人而均質(zhì)流動(dòng)的，在某些特殊的歷史時(shí)期，“人力”可能極大地影響時(shí)間的方向和效用：既可能人為地使自己的時(shí)間減緩?fù)踔翉默F(xiàn)在拉回過(guò)去，也可能奮起直追，奔向未來(lái)，在較短的時(shí)間趕上甚至超越經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)展的他者。

Deng等敲除肝癌細(xì)胞SMMC-7721中TMEM16A后，p38的磷酸化水平降低，肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)也受到抑制，表明TMEM16A激活了p38 信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[4]。另有研究表明，TMEM16A 通過(guò)激活 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)促進(jìn) HNSCC 的發(fā)生和發(fā)展[11]。我們?cè)谌橄俳?rùn)性導(dǎo)管癌組織水平研究了TMEM16A表達(dá)與p-p38表達(dá)的關(guān)系，我們的結(jié)果分析表明，TMEM16A表達(dá)與p-p38表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，均與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。以上提示，TMEM16A可能通過(guò)激活p38信號(hào)通路而促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移，而TMEM16A與p38在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中具體的關(guān)聯(lián)和機(jī)制如何則有待于深入的研究。