靳麗麗，王瑞萍，孫夢，吾拉爾·阿德力，任雅璠，高彧，馮樹梅

（新疆醫(yī)科大學(xué)1臨床學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)中心，烏魯木齊 830011 ）

燒傷是物理、化學(xué)、放射等諸多因素作用于機(jī)體所造成的一種極其復(fù)雜的外傷性疾病[1,2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國燒傷年發(fā)病率約為1.5%～2%，即每年約有2000萬人遭受不同程度燒傷。大面積深度燒傷患者的治療，要求創(chuàng)傷后創(chuàng)面快速愈合，修復(fù)后創(chuàng)面不但外觀、厚度或皮膚高度接近正常，同時(shí)其微細(xì)結(jié)構(gòu)也要接近正常皮膚，甚至含有各種皮膚附件（汗腺、毛囊、皮脂腺等）。由此，加速創(chuàng)面愈合與促進(jìn)受傷皮膚修復(fù)后功能的重建已成為組織修復(fù)領(lǐng)域需要解決的重大問題[3]。

創(chuàng)面愈合是一個復(fù)雜而又高度協(xié)調(diào)的過程，包括炎性反應(yīng)、組織細(xì)胞增殖和組織重建3個互相重疊但又具有不同特點(diǎn)的階段[4]。大量研究證實(shí)，在體液滲出、創(chuàng)面愈合、瘢痕形成等過程中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）均有參與[5]。血管損傷后6～12h血漿VEGF達(dá)高峰，48～72h逐漸下降，與燒傷休克期體液滲出病理生理過程一致[6]。 通過燒傷病人與健康者血清VEGF濃度對比研究后發(fā)現(xiàn)，燒傷后血漿VEGF水平迅速增高直至燒傷愈合后下降，同時(shí)局部組織腫脹，從而推測VEGF對嚴(yán)重?zé)齻∪梭w液滲出腫脹有特定作用[7]，并且血管內(nèi)皮生長因子可促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞[8-10]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化[11]。此外，表皮干細(xì)胞（epidermal stem cells, ESCs）在皮膚傷口愈合及皮膚新陳代謝更新過程中起著至關(guān)重要的作用[12]。ESCs脫黏附離巢后才具有遷移能力，并最終通過再上皮化修復(fù)創(chuàng)面，故ESCs脫黏附離巢是啟動包括燒傷創(chuàng)面在內(nèi)的皮膚創(chuàng)面自行愈合的關(guān)鍵步驟[13]。

為明確外源性VEGF對燒傷愈合的作用，本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠II度燙傷模型，分別局部使用外源性VEGF及其抑制劑，觀察不同時(shí)期創(chuàng)傷愈合過程的差異，以B1整合素陽性細(xì)胞顯示表皮干細(xì)胞趨化、定向遷移的差異，為臨床治療熱損傷皮膚缺損提供依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物

40天健康Wistar大鼠48只（新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物許可證：SCXK（新）2016-0003），雌雄不限，體重180g～200g。

2 主要試劑

VEGF（德國PEPROTECH），阿西替尼（輝瑞醫(yī)藥保健有限公司），Phospho-ITGB1（Thr788）polyclonal antibody （E-AB-20904）武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（兔來源），兔二步法二抗試劑盒（PV-6002）、DAB染色試劑盒（ZLI-9018）由北京中衫金橋公司提供 。

3 動物模型制備[3]

Wistar大鼠48只，隨機(jī)分為VEGF組、空白對照組和阿西替尼（VEGF抑制劑）組。所有實(shí)驗(yàn)鼠均正常飼養(yǎng)，燙傷前1d用電動剃毛機(jī)推去背部脊柱兩側(cè)毛，10%硫化鈉溶液脫毛[14]，脫毛面積約5×10cm2，使用2%戊巴比妥納（40mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后將動物背部朝上固定，將水浴預(yù)熱到100℃的50g砝碼（直徑為2.0cm）稍加壓力壓于大鼠背部脊柱上下脫毛區(qū)，持續(xù)15s，形成皮膚II度燙傷模型（病理切片證實(shí)），每只大鼠共2個燙傷創(chuàng)面。燙傷后空白對照組背部涂抹紅霉素軟膏預(yù)防感染，自由飼養(yǎng)。VEGF組傷后立即在每個傷口兩邊取對稱兩點(diǎn)由邊緣向中央經(jīng)皮下注射0.2μg/ml VEGF溶液（0.02ml/cm2）；阿西替尼組由邊緣向中央經(jīng)皮下注射10μg/ml阿西替尼溶液（1ml/kg）；空白對照組不做處理，各組注射完畢后均在燙傷部位涂抹紅霉素軟膏。每只大鼠分籠飼養(yǎng)，每日給藥1次并用紅霉素軟膏涂抹，連續(xù)7d。飼養(yǎng)期間動物自由進(jìn)食、水。

4 觀測指標(biāo)及方法

創(chuàng)面肉眼觀察：每日觀察創(chuàng)面情況，如創(chuàng)面水腫滲出程度、是否干燥、有無分泌物、創(chuàng)周紅腫變化等。

創(chuàng)面面積計(jì)算及創(chuàng)面愈合程度：自燙傷后第1d用直角尺測量燙傷創(chuàng)面面積 并記錄計(jì)算愈合率，每日一次，直到第21d。創(chuàng)面愈合率（%）＝（開始燙傷面積－未愈合創(chuàng)面面積）/開始燙傷面積[14]。計(jì)算燙傷后2d、4d、8d，14d 及 21d的創(chuàng)面愈合程度。創(chuàng)面愈合速率=（第n天的燙傷面積-第n+m天未愈合創(chuàng)面面積）/m（n和m為非零自然數(shù)）。

創(chuàng)面組織病理學(xué)檢查：分別于燙傷后第2d、第4d、第8d、第14d和第21d每組隨機(jī)斷頸處死3只鼠，各組動物分別處死后每個創(chuàng)面切取一半的皮膚組織，用4℃生理鹽水漂洗，洗凈創(chuàng)面組織淤血，鋪平裝在包埋盒以10%中性福爾馬林緩沖液固定，常溫保存，作組織石蠟切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察表皮層和真皮層的變化，判斷燙傷深度及愈合過程中炎性細(xì)胞變化情況；皮膚組織石蠟切片作SP二步法免疫組織化學(xué)染，觀察B1整合素免疫反應(yīng)性

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間進(jìn)行比較及方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 VEGF促進(jìn)創(chuàng)面愈合

肉眼觀察（圖1）：傷后2d大鼠燙傷皮膚壞死漸漸變黑，失水干燥、發(fā)硬，表面凹凸不平，壞死皮膚邊緣翹起周圍皮膚收縮，界限清晰。傷后5～7d，痂皮形成，表面棕黃色，燙傷區(qū)域縮小。同時(shí)傷口周圍正常皮膚收縮，使傷口總面積逐漸縮小。VEGF組、空白對照組、阿西替尼組動物的傷口表現(xiàn)基本類似；傷后21d各組傷口愈合差異顯著，VEGF組傷口已基本上皮化，但有部分大鼠傷口也有硬痂且不易剝脫?？瞻讓φ战M傷口中部大片硬痂覆蓋，阿西替尼組表現(xiàn)與空白對照組相同但仍有部分創(chuàng)面為開放性傷口，可見淡黃色分泌物和組織紅腫。

圖1 VEGF對燙傷創(chuàng)面殘留面積的影響。箭頭所示殘留面積Fig.1 Effect of VEGF on residual area of scalded wound. Arrow: the residual area of scalded wound

病理組織學(xué)觀察（圖2）：燙傷后第2d 三組均可見損傷累及真皮及部分網(wǎng)織層，毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器壞死，創(chuàng)面有大量炎性細(xì)胞浸潤、漿液和纖維素滲出，成纖維細(xì)胞數(shù)量增加；第8d，VEGF組可見表面有壞死的表皮組織，表皮細(xì)胞增殖移行（主要為棘層細(xì)胞），大量肉芽組織，大量新生毛細(xì)血管；空白對照組的燙傷部位累及真皮乳頭層，表面有壞死的表皮組織，可見少量表皮細(xì)胞增殖（主要為棘層細(xì)胞），部分新生毛細(xì)血管，偶有肉芽組織；阿西替尼組燙傷部位累及真皮乳頭層，表面有壞死的表皮組織，大量新生的毛囊和皮脂腺由真皮網(wǎng)狀層遷移至乳頭層；第14d，VEGF組可見表皮增厚明顯，間質(zhì)增多，毛囊增多，表皮細(xì)胞增殖旺盛，大量肉芽組織增殖達(dá)到高峰，大量新生毛細(xì)血管；第21d，VEGF組燙傷部位基本修復(fù)，表皮層結(jié)構(gòu)基本完整，偶有肉芽組織，大量膠原纖維形成；空白對照組表皮層增殖，少部分未愈合，可見部分炎細(xì)胞浸潤，有較多肉芽組織；阿西替尼組創(chuàng)面未完全愈合，新生毛細(xì)血管生成，毛囊和皮脂腺少見，大量炎細(xì)胞浸潤。

圖2 VEGF對燙傷創(chuàng)面組織病理學(xué)影響的HE染色觀察。比例尺，10μmFig. 2 Observation by HE stain for effect of VEGF on histopathology of scalded wounds. Scale bar, 10μm

2 VEGF在中晚期使II度燙傷的創(chuàng)面愈合速度加快和愈合率提升

VEGF組燙傷后1～8d愈合速度雖然最慢，但整體愈合速度呈上升趨勢，隨著愈合時(shí)間延長，到傷后第8d，VEGF 組愈合速度逐漸加快，第15d愈合速度達(dá)到最快超過其余兩組且繼續(xù)加快，燙傷后21d傷口幾乎完全愈合，僅留一細(xì)線狀傷疤。在空白對照組，1～7d愈合速度最快，于第4d愈合速度達(dá)到峰值，隨后迅速下降，且于第7～21d愈合速度趨于穩(wěn)定但仍有輕微減慢趨勢，傷后第21d傷口仍有大塊傷疤覆蓋。阿西替尼組愈合速度變化趨勢與空白組相似，但均低于空白組，且傷后第21d傷口仍為開放性傷口，可見黃色分泌物（圖3）。

VEGF組創(chuàng)面愈合速度在中晚期最快且呈遞增趨勢，其余兩組在中晚期愈合速度減慢。燙傷后21d VEGF組創(chuàng)面的平均愈合率為85.31%。而空白對照組創(chuàng)面愈合率為77.52%，阿西替尼組創(chuàng)面愈合率為65.82%，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示VEGF能有效促進(jìn)大鼠皮膚II燙傷后傷口的愈合（圖4）。

圖3 VEGF對燙傷創(chuàng)面愈合速度的影響Fig. 3 Effect of VEGF on scalded wound healing speed

圖4 VEGF對燙傷創(chuàng)面愈合率的影響Fig. 4 Effect of VEGF on scalded wound healing rate

3 VEGF加速燙傷創(chuàng)面的β1整合素表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色顯示，三組皆于傷后2d發(fā)現(xiàn)β1整合素陽性細(xì)胞。VEGF組β1整合素陽性細(xì)胞率比空白對照組和阿西替尼組陽性細(xì)胞率更早，于第8d達(dá)到峰值，峰值顯著高于其他兩組，之后迅速下降但總體保持較高水平。空白對照組陽性細(xì)胞率達(dá)峰時(shí)間（第14d）早于阿西替尼組，但峰值低于VEGF組，之后持續(xù)下降。阿西替尼組陽性細(xì)胞率達(dá)峰時(shí)間最晚（第21d），水平一直較低（圖5，圖6）。

討 論

本實(shí)驗(yàn)采用砝碼水浴法建立大鼠深Ⅱ度燙傷模型，以VEGF及其抑制劑阿西替尼干預(yù)嚙齒動物熱損傷模型，研究皮膚愈合過程的動態(tài)性變化特點(diǎn)及表皮干細(xì)胞的遷移情況。我們研究發(fā)現(xiàn)，造模后21d VEGF組創(chuàng)面的平均愈合率最高，空白對照組創(chuàng)面次之，阿西替尼組創(chuàng)面愈合率為最低。阿西替尼作為VEGF抑制劑，可以抑制受體酪氨酸激酶VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3的活性從而阻止VEGF與受體結(jié)合[15]，阿西替尼組自第8d后愈合速度，愈合率均低于空白對照組和VEGF組，表明在燙傷中晚期阿西替尼抑制VEGF，進(jìn)而影響皮膚愈合進(jìn)程。我們的實(shí)驗(yàn)表明，在皮膚修復(fù)中晚期，VEGF能有效促進(jìn)大鼠皮膚II燙傷后傷口的愈合。此外，VEGF組毛發(fā)茂密生長，表明VEGF不僅促進(jìn)血管生成，還具有調(diào)控毛囊周期性循環(huán)和促進(jìn)毛發(fā)生長的作用，可在恢復(fù)皮膚完整結(jié)構(gòu)和功能的研究和治療中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[16]。

圖5 免疫組織化學(xué)染色顯示第8d VEGF組β1整合素陽性細(xì)胞增加。A，VEGF組；B，阿西替尼組創(chuàng)；C，空白對照組；比例尺，10μmFig. 5 Immunohistochemical staining showed that β1 integrin positive cells increased in VEGF group on the 8th day. A, VEGF group； B, axitinib group； C, blank control group； scale bar, 10μm

圖6 VEGF對燙傷創(chuàng)面β1整合素陽性細(xì)胞率的影響。與對照組比較：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01Fig. 6 Effect of VEGF on integrin β1 positive cell rate in the scalded wound. Compared with the control group: *, 0.01＜P ＜ 0.05,**, P ＜ 0.01

與此同時(shí)我們也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，VEGF組在燙傷早期（1～8d）愈合速度顯著低于其余兩組。而既往研究結(jié)果表明，VEGF mRNA在正常皮膚內(nèi)表達(dá)水平低，燙傷后創(chuàng)面組織中表達(dá)明顯增加；傷后1d即迅速升至峰值，傷后3～14d表達(dá)逐漸下降，燙傷后6～12h血漿VEGF即達(dá)高峰[5]；早期機(jī)體由于燙傷造成創(chuàng)面缺血缺氧，通過低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）介導(dǎo)，與VEGF 5’端增強(qiáng)因子作用，迅速誘導(dǎo)VEGF mRNA的表達(dá)[17]， 導(dǎo)致早期內(nèi)源性VEGF大量釋放。本實(shí)驗(yàn)中早期VEGF組愈合速率低可能由于負(fù)反饋機(jī)制所致，燙傷早期內(nèi)源性VEGF大量釋放，外源性VEGF的同步干預(yù)啟動體內(nèi)負(fù)反饋抑制作用，從而抑制VEGF發(fā)揮作用，愈合中晚期血漿內(nèi)源性VEGF逐漸減少，抑制作用解除，二者共同發(fā)揮促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用。

皮膚結(jié)構(gòu)的完全恢復(fù)，不僅表現(xiàn)在皮膚缺損修復(fù)，皮膚厚度恢復(fù)，還體現(xiàn)在皮膚附屬器結(jié)構(gòu)的恢復(fù)和重建，本實(shí)驗(yàn)中VEGF組毛發(fā)生長濃密，顯微鏡下亦可見大量毛囊結(jié)構(gòu)，揭示VEGF還可促進(jìn)毛囊的生成。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，皮膚損傷后，隨炎性細(xì)胞的趨化、滲出，VEGF在表皮及毛囊上皮細(xì)胞的表達(dá)逐漸減弱，而在中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的表達(dá)逐漸增加[18]。 本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用外源性VEGF可以彌補(bǔ)內(nèi)源性VEGF在表皮及毛囊表達(dá)減弱的缺點(diǎn)，從而促進(jìn)實(shí)驗(yàn)組表皮及毛囊再生修復(fù)，達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面功能性愈合的目的。

燒傷后，ESCs脫黏附離巢、遷移、再上皮化是創(chuàng)面修復(fù)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[13]本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)平均β1整合素陽性細(xì)胞率：VEGF組＞空白組＞阿西替尼組，表明VEGF具有促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移分化的作用；而阿西替尼組達(dá)峰時(shí)間最晚且水平一直很低，可能是由于其抑制內(nèi)源性VEGF與相應(yīng)受體結(jié)合達(dá)到抑制延遲表皮干細(xì)胞的遷移分化的效果。此外我們發(fā)現(xiàn)VEGF組達(dá)峰明顯提前于阿西替尼組和空白對照組，即VEGF組ESCs遷移速度最快，并且最早達(dá)到表皮全層分布，表明VEGF能夠加速基底層殘留的ESCs向創(chuàng)緣中心增殖遷移分化，縮短實(shí)現(xiàn)再上皮化的時(shí)間，更快地促進(jìn)創(chuàng)面愈合并且與HE染色結(jié)果相吻合。

皮膚愈合的機(jī)制頗為復(fù)雜，研究人員運(yùn)用不同實(shí)驗(yàn)動物（大鼠、小鼠、兔、豚鼠）、多種造模方法（皮膚線性損傷、熱損傷、機(jī)械皮膚切除創(chuàng)傷）試圖闡明影響創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵因子和機(jī)制。研究中發(fā)現(xiàn)，不同種屬動物由于皮膚結(jié)構(gòu)差異，創(chuàng)傷愈合過程細(xì)胞因子表達(dá)特點(diǎn)有所不同，皮膚修復(fù)機(jī)制也有所不同。如嚙齒動物的研究表明，在創(chuàng)傷修復(fù)中皮膚收縮力首先發(fā)揮作用，其次才是再上皮化[19,20]，提示各種類型的動物模型，不能完全復(fù)制和模擬人體皮膚創(chuàng)傷過程。本研究運(yùn)用嚙齒動物大鼠，以砝碼水浴建立深Ⅱ度燙傷模型，通過VEGF及其抑制劑，證實(shí)VEGF在愈合中后期加快創(chuàng)面愈合速度，縮短了病程，并且促進(jìn)毛囊汗腺的再生使修復(fù)后的創(chuàng)面在外觀、功能與正常皮膚相近，但本研究結(jié)果對于人體臨床熱損傷修復(fù)的應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。