封敏，張霞，董娟娟，李光，阿麗亞·奧斯曼，包晗，李盈，買爾哈巴·賽地克孜，李秀梅*

（新疆醫(yī)科大學(xué)1附屬腫瘤醫(yī)院，2臨床醫(yī)學(xué)2015-1班，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，4臨床醫(yī)學(xué)2016-1班，烏魯木齊830011）

食管癌（esophageal cancer，EC）是世界常見惡性腫瘤之一，其死亡率位居癌癥死亡人數(shù)的第6位，5年生存率僅為15%～25%[1]。EC患病率因地區(qū)變化而顯著不同，在新疆哈薩克族食管癌發(fā)病率（155.9/10萬）明顯高于其他少數(shù)民族[2]。MicroRNA 是一類具有組織特異性或發(fā)育階段特異性表達(dá)特征的非編碼調(diào)控的小RNA[3]，其通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)影響胚胎的生長發(fā)育、 細(xì)胞周期和細(xì)胞分化等。MicroRNA21是一個(gè)公認(rèn)的致癌性小RNA，其表達(dá)水平在多種腫瘤標(biāo)本及細(xì)胞系中異常升高。平滑肌蛋白 22α （smooth muscle protein 22-α, SM22α） 是本課題采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)篩選出的差異蛋白，是一種重要的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，而細(xì)胞骨架改變是腫瘤細(xì)胞表型發(fā)生變化的基本過程之一[4]。MicroRNA21與SM22α在食管癌中的研究尤其是哈薩克族食管癌相對(duì)較少，故本研究主要對(duì)microRNA21與SM22α基因在哈薩克族食管鱗癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析，并結(jié)合臨床病理參數(shù)進(jìn)一步分析其臨床意義，以篩選可能的分子標(biāo)志物。

材料和方法

1 臨床資料

162例石蠟包埋食管鱗狀細(xì)胞癌組織均取自于2012年至2015年新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理檢驗(yàn)科，另收集50例正常食管鱗狀上皮組織作為正常對(duì)照組。

47例新疆哈薩克族食管癌組織及遠(yuǎn)端正常組織標(biāo)本均取自2016至2018年新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除術(shù)，患者術(shù)前均未接受放化療，手術(shù)中取材后迅速將標(biāo)本置于液氮中，置于-80℃冰箱貯存。病理切片均診斷為鱗狀上皮細(xì)胞癌，男性30例，女性17例。腫瘤臨床分期:按國際TNM分期(UICC, 2009年), I期，2例，Ⅱ期17例，Ⅲ期29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例；中低分化28例，高分化19例。

2 試劑

MiScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、引物均購自北京天根公司；RNA提取試劑Trizol購自美國Promega公司；兔抗SM22α多克隆抗體、山羊抗兔IgG均購自北京中杉金橋生物公司，引物序列如下：microRNA21-Forward：5’-ACAGCCCATCGACTG-3’；U6-Forward:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’； SM22α-Forward 5’-CTCAGCCAGCCACATCCACAAG-3’,Reverse5’-TCCTCCAGCTCCTCGTCATACTTC-3’； GAPDH-Forward 5’-TCTGGAGGTCATCTCGGCTGTTC-3’, Reverse 5’-TCCTCACTGCGGCTGTCTGG-3’。

3 免疫組織化學(xué)

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2溶液室溫孵育10min；PBS沖洗3次，山羊血清進(jìn)行封閉，室溫孵育10min，一抗SM22α（1：50）4℃孵育避光過夜；PBS沖洗，山羊抗兔IgG室溫孵育10min；PBS沖洗，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育10min；DAB呈色、脫水、透明、封片。

4 組織總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR

采用Trizol試劑一步法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度。以提取的RNA為模板，按miScript II RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以得到的cDNA為模板，在實(shí)時(shí)定量 PCR儀（Bio-Rad, CFX96 Touch）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為 20μl，反應(yīng)條件：94℃ 2min；94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)及頻率表示；基因在哈薩克族食管癌組織和遠(yuǎn)端無癌組織中表達(dá)量、各基因與哈薩克族食管癌臨床病理因素關(guān)系分析，數(shù)據(jù)采用2-vvCt法，t檢驗(yàn)，Spearsman雙變量相關(guān)性分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織SM22α免疫反應(yīng)性增強(qiáng)

SM22α在正常食管黏膜呈陰性或弱陽性，在食管鱗狀細(xì)胞癌組織細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)成強(qiáng)陽性，反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀。SM22α在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率（87.0%）顯著高于食管正常黏膜組織（36.0%）（表1，圖1）。

表1 SM22α在食管鱗癌組織及正常食管黏膜組織中的表達(dá)率比較Tab. 1 Comparison for expression rate of SM22α in esophageal squamous cell carcinoma and normal esophageal mucosa

圖1 正常食管黏膜和食管鱗狀細(xì)胞癌組織中SM22α表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 A和B，正常食管黏膜；C和D，食管鱗狀細(xì)胞癌組織；比例尺，20μmFig. 1 Immunohistochemical examination for expression of SM22α in normal esophageal tissue and esophageal squamous cell carcinoma tissue. A and B, normal esophageal tissue； C and D, esophageal squamous cell carcinoma； scale bar, 20μm

2 哈薩克族食管癌中 microRNA21和 SM22α mRNA表達(dá)水平升高

熒光定量PCR 檢測(cè)顯示，哈薩克族食管癌組織中microRNA21和SM22α mRNA相對(duì)表達(dá)量較癌旁組織明顯上調(diào)，其中microRNA21 mRNA上調(diào)約2.5倍，SM22α mRNA上調(diào)約2倍（圖2）。microRNA21與SM22α在腫瘤組織中表達(dá)正相關(guān)（r=0.334，P=0.01）。

3 哈薩克族食管癌中 microRNA21 和 SM22α mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

47例哈薩克族食管癌組織中，microRNA21在低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期Ⅱb～Ⅲ的腫瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)，SM22α在臨床分期Ⅱb～Ⅲ的腫瘤組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中的表達(dá)顯著升高（表2）。Spearsman雙變量相關(guān)分析顯示，microRNA21高表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，SM22α與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表2 哈薩克食管癌中microRNA21和SM22a mRNA與臨床病理因素Spearsman雙變量相關(guān)性分析Tab.2 Spearsman bivariate correlation analysis of correlation between clinicopathological factors and mRNA level of microRNA21 and SM22a in kazakh esophageal cancer

圖2 MicroRNA21和SM22α mRNAs在食管癌組織及遠(yuǎn)端癌旁組織中表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。*，P＜0.01Fig. 2 qRT-PCR detection for expression of microRNA21 and SM22α mRNAs in esophageal squamous cell carcinoma and normal esophageal mucosa. *, P＜0.01

討 論

食管癌是我國乃至世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤，食管癌的發(fā)病率具有明顯的地域性，在新疆哈薩克族食管癌發(fā)病率最高，盡管手術(shù)切除術(shù)及放化療法是其主要的治療手段，但因缺乏早期預(yù)警指標(biāo)，故食管癌患者五年生存率并不理想。因此，尋找食管癌早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物有重要意義。目前研究顯示[5-7]，microRNA 的異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展及診斷治療之間具有重要的相關(guān)性。 microRNA-21是人類發(fā)現(xiàn)較早的microRNAs之一，在多種實(shí)體腫瘤（肺癌、胃癌、肝癌等）及血液系統(tǒng)疾?。粤馨图?xì)胞性白血病、B細(xì)胞性淋巴瘤等）中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和治療耐藥等密切相關(guān)，也是第一個(gè)在腫瘤病人血清中檢測(cè)到的microRNA，其在人類microRNA功能學(xué)的研究中不可忽視。本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了47例哈薩克族食管鱗癌患者組織microRNA-21的表達(dá)水平，結(jié)果顯示哈薩克族食管鱗癌組織中microRNA-21 mRNA的表達(dá)水平是遠(yuǎn)端無癌組織的2.5倍，提示 microRNA-21是一個(gè)潛在的癌基因，且microRNA-21高表達(dá)與低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，在低分化腫瘤組織其表達(dá)明顯高于中高分化腫瘤組織，有淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中microRNA-21表達(dá)顯著增高；隨著病程發(fā)展，microRNA-21在Ⅱb～Ⅲ 期的腫瘤組織表達(dá)顯著高于Ⅰ～Ⅱa期腫瘤組織。以上結(jié)果提示，在哈薩克族食管癌發(fā)生發(fā)展過程中，microRNA-21表達(dá)失調(diào)，microRNA-21高表達(dá)作為一種癌基因促進(jìn)食管癌細(xì)胞的生長分化、侵襲轉(zhuǎn)移的過程。相關(guān)研究顯示[8,9]，食管鱗狀細(xì)胞癌患者血漿microRNA-21的表達(dá)水平顯著高于良性食管疾病組和對(duì)照組患者，microRNA-21水平高表達(dá)可應(yīng)用于食管鱗狀細(xì)胞癌的早期監(jiān)測(cè)。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符，但microRNA-21在多種腫瘤組織中均表達(dá)上調(diào)，缺乏特異性，作為腫瘤分子標(biāo)記物仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

SM22α是一種重要的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，也是一種分化型血管平滑肌細(xì)胞的表型標(biāo)志物，在細(xì)胞分化、黏附及遷移中發(fā)揮著重要作用，而細(xì)胞骨架改變是腫瘤細(xì)胞表型發(fā)生變化的基本過程之一。有關(guān)研究利用質(zhì)譜技術(shù)研究分析發(fā)現(xiàn)SM22α可能在腫瘤早期進(jìn)展過程中起促進(jìn)作用[10,11]。前期我們采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了162例哈薩克族食管鱗狀細(xì)胞癌石蠟包埋組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)SM22α陽性表達(dá)率顯著高于食管正常黏膜組織，且與浸潤程度、淋巴轉(zhuǎn)移高度正相關(guān)[12]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示哈薩克族食管癌組織中SM22α mRNA表達(dá)水平顯著升高，是遠(yuǎn)端無癌組織表達(dá)量的2倍，且與臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示SM22α高表達(dá)有利于腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。Nari研究結(jié)果[13]證實(shí)，SM22α可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)，作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解酶，MMP-9可以分解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲，這可能是SM22α高表達(dá)有利于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)原因。

綜上所述，在哈薩克族食管癌組織中，microRNA-21與SM22α表達(dá)上調(diào)，且microRNA-21高表達(dá)與SM22α高表達(dá)呈明顯正相關(guān)，提示microRNA-21與SM22α協(xié)同發(fā)揮作用共同促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，同時(shí)也提示microRNA-21與SM22α之間可能存在調(diào)控關(guān)系，但相關(guān)分子機(jī)制尚不明確有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。