王曉林，金玲玲，張瑤，曹仕瓊

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院1消化內(nèi)科，2內(nèi)分泌科，武漢 430077）

結(jié)直腸癌是全球第三大常見癌癥，約占所有新發(fā)腫瘤的10.0%，是男性癌癥相關(guān)死亡的第四大常見原因及女性死亡的第三大常見原因[1]。有統(tǒng)計(jì)顯示，早期確診治療的結(jié)直腸癌5年生存率可達(dá)90%，腫瘤組織浸潤(rùn)局部淋巴結(jié)時(shí)5年生存率仍可達(dá)71%，當(dāng)發(fā)生遠(yuǎn)處組織轉(zhuǎn)移時(shí)5年生存率只有13%[2]，而我國(guó)結(jié)直腸癌的早期檢出率非常低。結(jié)直腸癌有一個(gè)很長(zhǎng)的、可檢測(cè)的潛伏期，從抑癌基因突變到出現(xiàn)結(jié)腸鏡下可以發(fā)現(xiàn)的腺瘤這個(gè)過程需要將近10年[3]。RPN11是蛋白酶體19S調(diào)節(jié)顆粒中的重要組成部分之一，具有去泛素化酶活性，也是酵母蛋白酶體中唯一不可缺少的去泛素化酶。有研究表明[4]，RPN11與細(xì)胞分裂的周期有一定的相關(guān)性，降低RPN11的表達(dá)可以引起細(xì)胞凋亡率的提高和細(xì)胞周期抑制。Ki67，也稱為MKi67，是位于人類第10號(hào)染色體上，是腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)核標(biāo)記物，甚至有研究表明，Ki67免疫染色陽(yáng)性是癌癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。因此，Ki67表達(dá)可以用來判斷細(xì)胞增殖活性及分化潛能。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于RPN11與結(jié)直腸癌的相關(guān)性研究較少，RPN11是否參與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖也尚未證實(shí)；Ki67可以用來判斷腫瘤細(xì)胞的增殖，但尚無關(guān)于RPN11、Ki67對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)性的研究。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)RPN11與Ki67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，并分析兩者之間的相關(guān)性，研究它們?cè)诮Y(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用以及與癌細(xì)胞增殖的相關(guān)性。

材料與方法

1 組織標(biāo)本收集及臨床資料

選取華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院2015至2017年病理科存檔石蠟包埋組織38例及普外科2018年4月至2018年9月手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織18例，同時(shí)取距離腫瘤＞10cm正常組織15例作為對(duì)照。新鮮組織標(biāo)本取于術(shù)后30min內(nèi)，取腫瘤組織、正常組織各一份，分別置于4%多聚甲醛中固定用于制作石蠟切片。所有病例信息資料齊全，均無代謝性疾病、帕金森病、自身免疫性疾病或其他腫瘤疾病史，術(shù)前均未進(jìn)行放化療等腫瘤疾病相關(guān)性治療。其中男性患者31例，女性患者25例；有淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這20例，無轉(zhuǎn)移者36例；左半結(jié)腸癌22例，右半結(jié)腸癌19例，直腸癌15例；腫瘤分期I-Ⅱ期36例，Ⅲ-Ⅳ期20例；所有組織經(jīng)病理證實(shí)均為腺癌除外1例印戒細(xì)胞癌，其中高中級(jí)分化結(jié)直腸癌34例，低級(jí)分化結(jié)直腸癌22例，所有正常結(jié)直腸組織均經(jīng)病理證實(shí)無腫瘤浸潤(rùn)。

2 材料

兔抗人PSMD14多克隆抗體（12059-1-AP)、兔抗人Ki67多克隆抗體(12059-1-AP)、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(SA00001-2)均購(gòu)自武漢三鷹公司(proteintech)；免疫組織化學(xué)SABC試劑盒（SA1022）、DAB顯色試劑盒（AR1022）購(gòu)自武漢博士德生物。

3 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)SABC法進(jìn)行所有56例標(biāo)本均由 4% 多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，3～5μm 連續(xù)石蠟切片，烤片，脫蠟，入水，破膜(2%Triton X-100)，加3% H2O2于37℃溫箱中避光反應(yīng)30 min，PBS 清洗；用pH6. 0檸檬酸液微波熱修復(fù)，PBS清洗；滴加5% BSA并放于37℃溫箱中反應(yīng)30min，甩去液體，滴加一抗（1:150），37℃孵2h)或4℃過夜)，PBS清洗； 滴加二抗，37℃溫箱孵育30min，PBS清洗； 加SABC液37℃孵育30min，PBS清洗；滴加DAB顯色液，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

4 結(jié)果判斷方法

每例切片隨機(jī)抽取5個(gè)高倍鏡視野，細(xì)胞陽(yáng)性率計(jì)算方法為：0%～5%，1分； 6%～50%，2分；51%～75%，3分；76%～100%，4分；染色強(qiáng)度評(píng)分為：無色，0 分；淡黃色，1分； 棕黃色，2分；棕褐色，3分。兩者得分相乘，≤8分為低表達(dá)；＞8分為高表達(dá)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)分析RPN11、Ki67的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

結(jié) 果

1 RPN11與Ki67在結(jié)直腸癌組織表達(dá)增強(qiáng)

RPN11主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，為棕黃色顆粒(圖1)，RPN11在結(jié)直腸癌組織細(xì)胞核中呈棕黃色至棕褐色顆粒樣著色，部分細(xì)胞質(zhì)中也可見棕黃色顆粒樣著色（圖1A），在正常結(jié)直腸組織中表達(dá)較少，部分細(xì)胞核中可以觀察到黃色顆粒樣著色，細(xì)胞質(zhì)中極少（圖1B）。RPN11在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率50.0%（28/56）明顯高于正常結(jié)直腸組織15. 0% （3/20）(0.01＜P＜0.05)。Ki67主要定位于細(xì)胞核為棕黃色顆粒(圖2)，Ki67在結(jié)直腸癌組織細(xì)胞核中呈棕黃色至棕褐色顆粒樣著色（圖2A），在正常結(jié)直腸組織表達(dá)較少，部分細(xì)胞核中可以觀察到黃色顆粒樣著色（圖2B）。Ki67在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率66.1%（37/56）明顯高于正常結(jié)直腸組織15. 0%（3/20）(0.01＜P＜0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，兩者在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（表1） 。

2 RPN11與Ki67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

χ2檢驗(yàn)顯示，RPN11和Kid7的表達(dá)在不同性別、年齡、部位，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同臨床分期、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間具有顯著差異(0.01＜P＜0.05)（表2) 。

圖1 RPN11在結(jié)直腸癌組織（A）及正常結(jié)直腸組織（B）中表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 比例尺，20μmFig. 1 Immunohistochemical examination for expression of RPN11 in colorectal cancer tissues (A) and normal colorectal tissues (B). Scale bar, 20μm

圖2 Ki67在結(jié)直腸癌組織（A）及正常結(jié)直腸組織（B）中表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 比例尺，20μmFig. 2 Immunohistochemical examination for expression of Ki67 in colorectal cancer tissues (A) and normal colorectal tissues (B). Scale bar, 20μm

表1 RPN11與Ki67在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性Tab. 1 Correlation between expression of RPN11 and Ki67 in colorectal cancer tissues

討 論

RPN11又稱PSMD14/poh1，是26S蛋白酶體的重要組成之一。26S蛋白酶體由一個(gè)20S核心顆粒（CP）和兩個(gè)19S調(diào)節(jié)顆粒（RP）組成，RPN11是蛋白酶體19S調(diào)節(jié)顆粒蓋子結(jié)構(gòu)中的特異性去泛素化酶，在調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，雙鏈DNA斷裂修復(fù)，胚胎干細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖等[4,6]。因此，RPN11成為近年來開發(fā)新型腫瘤藥物的熱門靶點(diǎn)之一。關(guān)于RPN11在腫瘤表達(dá)及作用的研究越來越多，Wang等[7]的研究表明，超活化的POH1-E2F1能調(diào)節(jié)促進(jìn)肝癌的發(fā)展；Luo等[4]的研究表明，RPN11在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，并可能參與乳腺癌細(xì)胞周期的調(diào)控；另外有研究證明[8]，敲低RPN11將顯著阻斷SNAIL誘導(dǎo)的食管癌，抑制體外腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲及體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移，并且食管癌患者RPN11高表達(dá)水平預(yù)示其預(yù)后不良；最近的一項(xiàng)研究[10]指出，RPN11與肝癌、食管癌等都有密切相關(guān)性，RPN11的高表達(dá)可能與腫瘤的預(yù)后不佳密切相關(guān)。敲低RPN11則可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、減弱其降解，增加p53和Bim的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

表2 RPN11、Ki67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性Tab. 2 Correlation between the expression of RPN11 and Ki67 in colorectal cancer and clinicopathological features

在本實(shí)驗(yàn)中，RPN11在正常結(jié)直腸癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)，也可見于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒；結(jié)直腸癌組織中RPN11表達(dá)率較正常組織顯著增高。推測(cè)RPN11高表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)RPN11可能參與了腫瘤細(xì)胞的異常增殖。

Ki67蛋白由兩條多肽鏈組成，其編碼基因位于人類10號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，存在于增殖活躍的細(xì)胞的G1、S、G2和M期中，而G0期則沒有表達(dá)，可以用來反映細(xì)胞群體增殖活性，Ki67是較為確定的細(xì)胞增殖的標(biāo)記基因之一[5，11]。Ki67與多數(shù)腫瘤有著密切關(guān)系，一項(xiàng)回顧性研究[12]表明，實(shí)施新型化療方案的乳腺癌患者中Ki67高表達(dá)的患者對(duì)化療更加敏感。一篇關(guān)于Ki67和胃腸道間質(zhì)瘤的meta分析中指出，Ki67可能是該腫瘤惡性風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)之一[13]，Verma等[14]的研究顯示Ki67在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲性有一定相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ki67在正常結(jié)直腸癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒；結(jié)直腸癌組織中Ki67表達(dá)率較正常組織顯著增高，這一結(jié)果與胡曉舒[15]等關(guān)于結(jié)直腸癌中Ki67表達(dá)情況的研究結(jié)果相同。結(jié)合既往研究，我們進(jìn)一步證實(shí)Ki67參與了結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的異常增殖。

通過分析患者的臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中RPN11、Ki67的陽(yáng)性表達(dá)率均與患者的年齡、性別、腫瘤部位均無明顯相關(guān)性，而與腫瘤的分化程度、臨床分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，即分化程度越低、臨床分期越晚及轉(zhuǎn)移越多，則RPN11、Ki67的表達(dá)量越高，提示RPN11和Ki67可能參與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，與結(jié)直腸癌的惡性程度及臨床分期相關(guān)，這將為臨床治療和預(yù)后提供一定的指導(dǎo)意義。

相關(guān)性研究分析顯示，RPN11和Ki67在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示RPN11與Ki67共同促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。Ki67是目前較為肯定的增殖細(xì)胞標(biāo)記基因[11]，并且參與腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)控，而RPN11的高表達(dá)也與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖有一定的關(guān)系，因此我們推測(cè)，兩者可能共同參與結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖，并且可能在調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期中起到協(xié)同作用。已有研究表明，敲低RPN11將導(dǎo)致26S蛋白酶體的功能受損，使活躍增殖的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯和死亡，這可能為克服硼替佐米耐藥提供新的思路[9]。Pan Li等[16]的一項(xiàng)關(guān)于結(jié)直腸癌患者的研究顯示，晚期結(jié)直腸癌患者中高Ki-67表達(dá)的患者比低Ki-67表達(dá)的患者預(yù)后更好，但早期患者的預(yù)后與 Ki-67的表達(dá)差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。近年來，靶向RNA干擾（RNAi）的技術(shù)受到廣泛的關(guān)注，研究已經(jīng)證實(shí)，siRNA介導(dǎo)的Ki67敲低導(dǎo)致體外細(xì)胞增殖的有效和特異性抑制[5]。因此，研究RPN11與Ki67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和相互作用將為研究結(jié)直腸癌的治療和預(yù)后提供新的方向。