屠 玨, 周衛(wèi)民, 蔡月琴, 凌 云, 陳民利

(1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/中醫(yī)藥科學(xué)院, 浙江中醫(yī)藥大學(xué), 杭州 310053；

2. 比較醫(yī)學(xué)研究所, 浙江中醫(yī)藥大學(xué), 杭州 310053)

惡性腫瘤一直以來(lái)是威脅人類健康和生命的重大疾病。近年研究[1,2]表明, 腫瘤細(xì)胞能破壞維持組織正常生長(zhǎng)和功能的生化機(jī)制, 促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成, 腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境之間的相互作用是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素, 腫瘤特殊的生理生化通路成為研究的熱點(diǎn)。對(duì)腫瘤細(xì)胞生化通路中酶及產(chǎn)物、相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的研究有利于闡明癌癥發(fā)生的異質(zhì)性, 發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物, 探尋新的個(gè)性化治療方法。

磷脂酶A2(phospholipase A2, PLA2)是一類具有磷脂分解活性的超家族酶類, 廣泛參與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的傳遞、炎癥及炎癥相關(guān)疾病等病理反應(yīng)[3,4],主要分為4 大類：胞漿型PLA2(cytosolic PLA2,cPLA2)、分泌型PLA2(secretory PLA2, sPLA2)、鈣離子非依賴型PLA2(Ca2+-independent PLA2,iPLA2)和脂蛋白相關(guān)PLA2(lipoprotein-associated PLA2, lp-PLA2)。近年來(lái)大量臨床研究表明，PLA2 家族在結(jié)腸癌[5]、卵巢癌[6]、乳腺癌[7]、食管癌[8]、肺癌[9]、前列腺癌[10]等多種腫瘤組織中高表達(dá), 而且PLA2 與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移均有密切的聯(lián)系, 有望成為具有高特異性的腫瘤治療新靶點(diǎn)[11,12]。目前，腫瘤動(dòng)物模型上有關(guān)PLA2表達(dá)的研究較少。根據(jù)2016 年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[13]，肺癌作為2015年我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是癌癥死亡的主要原因。胃癌、食管癌、肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率和死亡率其次。而卵巢癌的死亡率在女性各類生殖器官惡性腫瘤中居首，是婦科腫瘤的最危險(xiǎn)因素。因此, 本文構(gòu)建了肺癌、鼻咽癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、卵巢癌等8 種人癌細(xì)胞株裸小鼠移植瘤模型，觀察4 大類PLA2 在移植瘤模型的腫瘤組織、正常組織及荷瘤裸小鼠血清中的蛋白表達(dá)水平及表達(dá)特征，為裸小鼠移植瘤模型在PLA2 及腫瘤相關(guān)研究領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299 細(xì)胞、人低分化鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞、人肝癌HepG2 細(xì)胞、人胰腺癌SW1990 細(xì)胞、人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞、人胃癌SGC7901 細(xì)胞、人食管癌CaES-17細(xì)胞和人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO8910-PM 細(xì)胞，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。腫瘤細(xì)胞均用含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 或高糖DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

4～6周齡雌性BALB/c裸小鼠48只, 購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2012-0002]。每個(gè)腫瘤模型使用6 只動(dòng)物，飼養(yǎng)及無(wú)菌實(shí)驗(yàn)操作均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行[SYXK(浙)2013-0184]。

1.2 主要儀器與試劑

Axiovert 200 熒光倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司, Forma 3111 型細(xì)胞培養(yǎng)箱、1300 生物安全柜均購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司, RPMI 1640、DMEM高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，cPLA2、sPLA2、iPLA2、lp-PLA2 酶聯(lián)免疫試劑盒均購(gòu)自南京建成生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為(2.5～5)×107個(gè)/mL，每鼠頸背皮下接種0.2 mL。細(xì)胞懸液放置于冰上，接種過程必須在細(xì)胞懸液制備后1 h 內(nèi)完成。

1.3.2 ELISA檢測(cè)PLA2表達(dá) 移植瘤模型待腫瘤生長(zhǎng)至瘤體積達(dá)1 cm3后，小鼠頜下靜脈取血，分離血清，處死小鼠，剝?nèi)×鼋M織，選取距離腫瘤組織3 cm外的肩胛骨位置的肌肉組織作為正常組織。采用ELISA 法檢測(cè)腫瘤組織、正常組織及血清中PLA2 的蛋白表達(dá)。同時(shí)取正常裸小鼠血清做平行對(duì)照。方法簡(jiǎn)述如下： 按照ELISA試劑盒說明書，向剪碎的腫瘤組織、正常組織中加入冷PBS 充分勻漿，3 500 r/min 離心15 min取上清液。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成系列濃度后各50 μL依次加入, 待測(cè)樣品孔分別加入待測(cè)腫瘤組織、正常組織上清液和血清各10 μL, 再加樣本稀釋液40 μL。標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔每孔加入酶標(biāo)抗體100 μL, 充分混勻, 37 ℃溫育60 min； 洗滌后每孔加入底物，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液，酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(A)值。以標(biāo)準(zhǔn)品的A 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算樣品cPLA2、sPLA2、iPLA2 和lp-PLA2 的含量。

2 結(jié)果

2.1 不同移植瘤模型中腫瘤組織PLA2 蛋白表達(dá)

2.1.1 腫瘤組織cPLA2 的蛋白表達(dá) 8 種不同的裸小鼠移植瘤模型中，cPLA2 在腫瘤組織中的蛋白表達(dá)均極顯著高于正常組織(P＜0.01)(圖1)。

2.1.2 腫瘤組織sPLA2 的蛋白表達(dá) 8 種不同的裸小鼠移植瘤模型中，sPLA2 在腫瘤組織中的蛋白表達(dá)均極顯著高于正常組織(P＜0.01)(圖2)。

2.1.3 腫瘤組織iPLA2 的蛋白表達(dá) NCI-H1299、CNE-2、HepG2、SW1990、SGC-7901、CaES-17和HO-8910PM小鼠移植瘤模型中, 腫瘤組織iPLA2的蛋白表達(dá)均極顯著高于正常組織(P＜0.01)，而人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29 移植瘤模型中，腫瘤組織iPLA2的蛋白表達(dá)與正常組織相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖3)。

2.1.4 腫瘤組織lp-PLA2 的蛋白表達(dá) HT-29 移植瘤組織lp-PLA2 蛋白表達(dá)顯著高于正常組織(P＜0.05), 其余7 種小鼠移植瘤模型中，腫瘤組織lp-PLA2的蛋白表達(dá)均極顯著高于正常組織(P＜0.01)(圖4)。

與正常組織比較, **P＜0.01圖 1 裸小鼠移植瘤模型中腫瘤組織和正常組織cPLA2 的蛋白表達(dá)

與正常組織比較, **P＜0.01圖 2 裸小鼠移植瘤模型中腫瘤組織和正常組織sPLA2 的蛋白表達(dá)

與正常組織比較, **P＜0.01圖 3 裸小鼠移植瘤模型中腫瘤組織和正常組織iPLA2 的蛋白表達(dá)

與正常組織比較, *P＜0.05； **P＜0.01圖 4 裸小鼠移植瘤模型中腫瘤組織和正常組織lp-PLA2 的蛋白表達(dá)

表 1 裸小鼠血清中PLA2 的蛋白含量

2.2 血清中PLA2 的蛋白含量

結(jié)果顯示，8 種不同的移植瘤模型中，荷瘤裸小鼠血清中4種類型PLA2的蛋白含量均極顯著高于正常血清(P＜0.01)(表1)。

3 討論

研究表明[4]，PLA2超家族酶類主要通過催化細(xì)胞膜的甘油磷酸脂二(sn-2)位酰基水解，產(chǎn)生以花生四烯酸(arachidonic acid, AA)為主的游離脂肪酸及溶血磷脂。這些脂類是細(xì)胞內(nèi)生理生化通路的重要底物, 可進(jìn)一步通過自分泌或旁分泌產(chǎn)生PG E2、白三烯(leukort iene, LT)和血栓素(thromboxane, TX)等具有生物學(xué)活性的分子。這些活性分子具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、分化、運(yùn)動(dòng)，組織血管分布和幾乎所有組織的免疫監(jiān)督，而機(jī)體的這些正常功能在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的時(shí)候均會(huì)被腫瘤細(xì)胞所逆轉(zhuǎn)。因此, PLA2 通路與癌癥的發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[13], 肺癌仍是我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，環(huán)境污染導(dǎo)致的空氣質(zhì)量日趨惡化，肺癌發(fā)病率每年都在升高。同樣，在我國(guó)鼻咽癌已經(jīng)成為呼吸系統(tǒng)的高發(fā)腫瘤和主要病死因素, 預(yù)后相對(duì)較差, 生存率相對(duì)較低。其病因可能與遺傳、環(huán)境和EB 病毒感染等有關(guān)。隨著我國(guó)人口老齡化不斷加重，鼻咽癌的發(fā)病率和死亡率可能還將不斷上升[14]。同時(shí)數(shù)據(jù)顯示[15]，我國(guó)死亡率最高的癌癥依次分別是： 肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、結(jié)直腸癌，約占所有癌癥死亡人數(shù)的3/4，除了肺癌其他4種均為消化系統(tǒng)惡性腫瘤。并且，不良生活習(xí)慣、幽門螺旋桿菌等的感染使消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率一直居高不下。近年來(lái)，生活壓力、環(huán)境等原因?qū)е屡陨诚到y(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病率持續(xù)升高，其中卵巢上皮癌是女性生殖器官惡性腫瘤中死亡率最高的[16]。因此，研究呼吸、消化和生殖系統(tǒng)腫瘤動(dòng)物模型中PLA2的表達(dá)特征對(duì)PLA2與腫瘤的相關(guān)性研究具有重要的參考價(jià)值。

已知，哺乳動(dòng)物基因組編碼超過30 種PLA2或相關(guān)酶，主要包括cPLA2、sPLA2、iPLA2 和lp-PLA2 四大類。其中，cPLA2 共有6 個(gè)胞內(nèi)酶，在結(jié)腸、小腸及肺癌組織中觀察到cPLA2 高表達(dá)，同時(shí)在這些組織中檢測(cè)到高表達(dá)的COX-2、LOX-2、AA 和PGE2 等。我們利用人癌細(xì)胞株接種裸小鼠誘發(fā)的呼吸系統(tǒng)(肺癌、鼻咽癌)、消化系統(tǒng)(肝癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌)、生殖系統(tǒng)(卵巢癌)的不同移植瘤模型的腫瘤組織和血清中，均觀察到cPLA2 高表達(dá)，且極顯著高于正常組織和正常血清?，F(xiàn)已有研究[17,18]證實(shí)，cPLA2 通過促進(jìn)結(jié)腸組織PGE2 的產(chǎn)生, 與受體EP2 相互作用促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展。也有研究表明前列腺癌中cPLA2 的作用是激活sPLA2[19]。

sPLA2是最早發(fā)現(xiàn)也是PLA2超家族最大的一個(gè)分支。sPLA2 的表達(dá)和活性在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌和皮膚癌腫瘤組織中均顯著升高[20], 并且能通過水解磷脂產(chǎn)生類花生酸類物質(zhì),調(diào)控非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)展[21]?？梢姡琍LA2家族各類型酶還能通過相互作用共同參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在本文構(gòu)建的裸小鼠移植瘤模型中，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤組織中的sPLA2 表達(dá)水平極顯著高于正常組織, 且荷瘤裸小鼠血清中sPLA2 的表達(dá)水平亦極顯著高于正常裸小鼠, 與cPLA2 表達(dá)特征一致。有研究者[22]還發(fā)現(xiàn), 胃癌、腸癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤、肺癌等病人血清中sPLA2顯著高于健康個(gè)體, 并伴隨C反應(yīng)蛋白(CRP)和凝血因子的顯著升高，提示sPLA2 可能通過激活炎癥信號(hào)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。

同樣，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究[23,24]表明，iPLA2 參與Caspase-3 信號(hào)通路，通過啟動(dòng)下游事件包括PGE2 的產(chǎn)生，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)化療、放療過程中存活的腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤治療過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。而主要由成熟巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成和分泌的lp-PLA2一直被認(rèn)為是心血管疾病的炎癥標(biāo)志物，研究表明其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖、運(yùn)動(dòng)、粘附等均有影響。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)[25]，鼻咽癌細(xì)胞能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌lp-PLA2，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。因此，炎癥是PLA2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制之一。另有研究表明，lp-PLA2 的底物——血小板活化因子(PAF)有抗腫瘤生成的作用，因此lp-PLA2 可能通過酶解PAF 促進(jìn)腫瘤生成[26]。已有研究報(bào)道了癌癥病人腫瘤組織和血清中l(wèi)p-PLA2活性[27]和mRNA水平的升高[28]。本文在裸小鼠移植瘤中同樣觀察到iPLA2、lp-PLA2 在腫瘤組織和血清中的高表達(dá)。

此外, 公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)不同的腫瘤組織、正常組織和細(xì)胞中的蛋白表達(dá)分析結(jié)果表明[29]，cPLA2、sPLA2 和iPLA2 在多種癌癥的腫瘤組織中均顯示高表達(dá)，顯著高于正常組織。該特點(diǎn)沒有腫瘤類型的特異性。這在本文構(gòu)建的8 種不同癌癥的裸小鼠移植瘤模型中得到了較好的驗(yàn)證。此外，分析數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iPLA2 在17 種癌癥的腫瘤組織中均有表達(dá)且表達(dá)量差異不明顯。cPLA2α在肺癌和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)量明顯高于其他癌癥。sPLA2 在前列腺癌中的表達(dá)最高，在其余類別的癌癥中表達(dá)量相當(dāng)。而本文構(gòu)建的8種小鼠移植瘤模型由于選取的癌癥類型有限、選擇的腫瘤細(xì)胞株比較單一，也未對(duì)不同性別、不同生長(zhǎng)階段的腫瘤模型進(jìn)行研究，難以反應(yīng)不同癌癥之間的表達(dá)差異，是本文欠缺的地方，有待在今后研究中不斷完善和深入。

綜上所述，PLA2 在裸小鼠移植瘤模型的腫瘤組織和血清中均呈現(xiàn)高表達(dá)，無(wú)腫瘤類型特異性，具備癌癥臨床上PLA2 的表達(dá)特點(diǎn)[22]。本文研究結(jié)果為在人癌裸小鼠異種移植瘤模型中研究PLA2 與腫瘤的相關(guān)性提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。