續(xù)國強, 高繼萍, 劉茂林, 陳朝陽, 宋國華

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心, 實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室, 太原030001)

中國倉鼠(Cricetulus griseus)，俗稱中國地鼠,已廣泛應(yīng)用于遺傳學、腫瘤學、生物醫(yī)學等諸多領(lǐng)域。它的雙側(cè)頰囊薄，易于翻出且血管豐富，在腫瘤移植、各種口腔疾病研究及微循環(huán)研究中優(yōu)勢突出[1]。中國倉鼠基礎(chǔ)研究薄弱、標準化資料相對較少，至今尚未有適用于中國倉鼠的遺傳質(zhì)量標準，嚴重阻礙了近交系中國倉鼠的推廣和應(yīng)用。本研究以國內(nèi)外大量相關(guān)文獻為基礎(chǔ)，哺乳類實驗動物遺傳質(zhì)量控制GB14923-2010[2]為參照，群體遺傳學理論為依據(jù)，制定了中國倉鼠遺傳質(zhì)量標準。近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量標準的建立不僅使近交系中國倉鼠的遺傳質(zhì)量有據(jù)可依，為將來建立中國倉鼠遺傳信息庫奠定了基礎(chǔ)； 而且使我國實驗動物質(zhì)量標準體系進一步完善和發(fā)展，為將來制定動物源性生物藥物質(zhì)量標準提供借鑒； 可在很大程度上保證科研數(shù)據(jù)的可靠性、一致性和可重復(fù)性，對提升我國實驗動物科學自主創(chuàng)新的研究水平，進而提高我國在實驗動物領(lǐng)域的國際地位也具有重要的科學意義。

1 材料與方法

1.1 建系與繁殖

山西醫(yī)科大學薄家璐教授分別于1980 年和1981 年從北京郊區(qū)購回兩批野生中國倉鼠，經(jīng)模擬自然環(huán)境及籠養(yǎng)兩個階段后成功培育出四個家系； 由于近交衰退，保種至今的只有A 家系和E家系[3](山醫(yī)群體)。經(jīng)權(quán)威部門檢測認證, 該群體已達到近交系標準[4]。

1.2 命名

參照國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、國家標準委員會批準的實驗動物國家標準GB14923-2010并根據(jù)群體遺傳學理論制定。

1.3 建立檢測方法

近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量檢測采用微衛(wèi)星標記法。

1.3.1 微衛(wèi)星DNA富集文庫的構(gòu)建 利用中國倉鼠尾組織提取基因組DNA，隨后將其超聲打碎，選擇長度在500～1 000 bp的DNA片段進行末端補平。將形成平末端的基因組DNA沉淀濃縮并利用QIAquick 試劑盒回收后, 用電泳法檢測其回收濃度。把回收的DNA 與接頭以1∶100 的比例混合于10 μL 反應(yīng)體系, 14 ℃連接, 70 ℃滅活。然后將連接好的DNA 與DNA 的解鏈溫度(Tm)值相近的探針雜交后, 通過鏈霉親和素包被的磁珠進行富集。將富集的微衛(wèi)星DNA片段插入到pGEM-T載體上后轉(zhuǎn)入DH10B大腸桿菌，構(gòu)建中國倉鼠微衛(wèi)星DNA 富集文庫，取陽性克隆進行測序。

1.3.2 微衛(wèi)星引物的設(shè)計與篩選 應(yīng)用軟件Tandem Repeats Finder 查找重復(fù)序列，軟件Vec Screen 去除載體序列，軟件Consed 及Phrep 等進行拼接，利用軟件Primer 3.0 設(shè)計引物135 對。從這135 對引物中挑選易產(chǎn)生多態(tài)性的目標引物訂購合成。使用目標引物對中國倉鼠DNA進行PCR擴增，使用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產(chǎn)物多態(tài)性進行篩選。對多態(tài)性良好引物的正向鏈進行熒光標記。用標記的引物對組織DNA進行PCR擴增, PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進行STR 掃描，然后對其基因型進行判讀。從微衛(wèi)星富集基因組DNA文庫中, 分離鑒定了17個新的微衛(wèi)星位點并對其進行了分析。

2 近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量標準

2.1 定義

通過全同胞兄妹交配或親子交配培育，且最少持續(xù)20代，全部個體均有一對共同祖先來自于第20 代或其以后代數(shù)的品系稱為近交系[5]。

2.2 命名

近交系中國倉鼠嚴格按照小鼠標準化遺傳命名國際委員會制定的命名法及中華人民共和國GB14923-2010 標準命名。

2.3 繁殖

近交系中國倉鼠繁殖方法的選用原則是, 在不發(fā)生遺傳污染和保持其同基因性的條件下, 利用近親繁殖盡可能提高品系的純合度，使其近交系數(shù)無限接近100%。無論是引進還是自己培育，一般均采用單線法、平行線法及優(yōu)選法中的一種。

引種： 作為繁殖原種的近交系中國倉鼠不僅要符合我國實驗動物管理相關(guān)規(guī)定，還應(yīng)有完善的品系名稱、生物學特性、育種單位和遺傳背景等資料且來源清楚[6]。

交配： 在群體中挑選3月齡個體進行全同胞交配。每日均對倉鼠種群進行發(fā)情周期檢測，挑選發(fā)情期母鼠合籠交配。近交系中國倉鼠供應(yīng)群及擴大群中任意個體均在核心群中有5 代以內(nèi)的共同祖先，核心群還可根據(jù)相應(yīng)的選育目的，根據(jù)其生物學、遺傳學等特性挑選與配種，且盡可能選用綜合優(yōu)選法進行配種。

交配后管理： 中國倉鼠獨居生存、性情殘暴，繁殖過程中往往發(fā)生撕咬造成雄鼠損失，所以要對其交配進行實時監(jiān)測，交配動作一經(jīng)完成，即檢查雌鼠陰道栓，及時分籠飼育。

2.4 遺傳質(zhì)量監(jiān)控

2.4.1 遺傳質(zhì)量標準 近交系中國倉鼠必須符合下列要求： ①除具有個體性、同基因性、基因純合性、遺傳穩(wěn)定性、分布的廣泛性及背景資料可查性等特性外，所引種或培育的近交系中國倉鼠還需完全符合近交系定義的規(guī)定； ②近交系的生存環(huán)境安全舒適，繁殖方法科學合理，生產(chǎn)保種記錄卡保存完整、清晰可查； ③經(jīng)微衛(wèi)星標記遺傳質(zhì)量檢測法檢測，質(zhì)量合格。

2.4.2 檢測方法及具體實施 ①檢測方法： 近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量檢測選用微衛(wèi)星標記檢測法。具體方法按附錄1 進行； ②取樣： 采用隨機取樣的方法，隨機從各飼養(yǎng)籠盒中選取成年倉鼠； ③結(jié)果的判定： 可用Gene Marker V 1.6 對STR 的掃描結(jié)果進行判讀，近交系中國倉鼠基因型為純合子，無雜峰且峰型均勻； ④檢測間隔： 任意時間、任何動物都可能發(fā)生自發(fā)突變，因而近交系動物遺傳質(zhì)量檢測的時間間隔一般不宜超過2 年。

3 討論

3.1 制定標準的迫切性和意義

中國倉鼠原產(chǎn)于我國黃河以北地區(qū)，全身被毛。它具有染色體大、易于辨認且數(shù)量較少的特點，在細胞遺傳、輻射遺傳、分子生物等領(lǐng)域的應(yīng)用尤為廣泛[7]。中國倉鼠山醫(yī)群體近交系由于近親交配而患有與人類Ⅱ型糖尿病類似的自發(fā)遺傳性糖尿病，群體發(fā)病率在20% 左右，是研究糖尿病預(yù)防、治療及預(yù)后理想的人類疾病動物模型； 其雄鼠睪丸下垂且碩大，適于微生物寄生，是理想的病原體接種器官； 除心電圖波形與人類大體一致外，它血液中血紅蛋白、紅細胞、網(wǎng)織紅細胞、白細胞、血清蛋白等含量也與人類相近，更是各類醫(yī)學實驗極佳的實驗動物模型。國外于1940年代末將中國倉鼠引入實驗室進行研究與繁殖[4]。我國張昌穎、李宏廣等學者曾先后對其進行了培育和馴化, 但由于未突破其近親衰退等限制未能延續(xù)。直至1980 年代初期，山西醫(yī)科大學薄家璐教授等從北京購回兩批野生中國倉鼠, 并對其進行馴養(yǎng)和繁殖； 經(jīng)過模擬自然環(huán)境和籠養(yǎng)兩個階段, 成功將其培育成符合國際標準的近交系實驗動物。一直以來, 學者們主要集中于對中國倉鼠繁殖、保種、生物學特征、遺傳標記、染色體核型等方面的研究。其分子進化、標準化特別是遺傳質(zhì)量標準化的研究尚屬空白[8], 目前尚沒有關(guān)于中國倉鼠遺傳質(zhì)量標準化的國家或地方標準。因此, 提供可靠的中國倉鼠遺傳背景數(shù)據(jù),建立中國倉鼠遺傳質(zhì)量標準就顯得極為迫切。建立近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量標準, 規(guī)范中國倉鼠的繁殖、保種及應(yīng)用, 將進一步完善我國實驗動物的質(zhì)量標準體系, 為建立更加完善和全面的實驗動物遺傳質(zhì)量控制標準和技術(shù)標準奠定基礎(chǔ)。

3.2 選擇微衛(wèi)星標記檢測法的優(yōu)勢

微衛(wèi)星序列是指存在于真核生物基因組中，以1～6個核苷酸為單位，經(jīng)多次串聯(lián)重復(fù)形成的簡單重復(fù)序列，其長度約為100 bp，是研究分子進化、構(gòu)建遺傳圖譜、診斷遺傳疾病常用的分子標記。選用微衛(wèi)星標記檢測中國倉鼠的遺傳質(zhì)量具有諸多優(yōu)勢，如在真核生物基因組中大約每隔10～50 kb 就存在一個微衛(wèi)星, 它不僅存在于非編碼區(qū)還存在于外顯子染色體上的任意區(qū)域； 微衛(wèi)星標記通常不具表型效應(yīng)，故對動物個體不造成傷害且無次級效應(yīng)。微衛(wèi)星標記為共顯性遺傳，能夠?qū)游锘蚣兒献雍碗s合子進行很好地區(qū)分。此外，微衛(wèi)星位點一般采用先擴增，再測序分離的檢測方法。可同時對多個微衛(wèi)星位點進行檢測且檢測耗時短，一般一次檢測可在1 d 內(nèi)完成[9]。

3.3 關(guān)于近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量檢測方法及結(jié)果分析

該標準提出了使用微衛(wèi)星標記檢測近交系中國倉鼠的遺傳質(zhì)量。目前, 可用于實驗動物遺傳質(zhì)量檢測的方法有生化標記法、形態(tài)學方法、免疫學方法等?；谖⑿l(wèi)星位點數(shù)量龐大、多態(tài)性豐富, 檢測方法快速簡便，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，被國內(nèi)外專家學者一致認為是動物遺傳質(zhì)量檢測的最佳分子標記，因此該標準決定選用微衛(wèi)星標記技術(shù)來檢測中國倉鼠的遺傳質(zhì)量。構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫及設(shè)計篩選微衛(wèi)星引物時[10], 利用超聲打碎、凝膠電泳回收、SNX 接頭連接、PCR 擴增、鏈親和素耦聯(lián)磁珠親和捕捉、感受態(tài)大腸桿菌轉(zhuǎn)化等成功構(gòu)建了中國倉鼠微衛(wèi)星DNA 富集文庫。通過查找重復(fù)序列、去除載體序列、拼接目的序列、引物設(shè)計、引物挑選、PCR 擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測、聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選等步驟成功篩選出適合于中國倉鼠微衛(wèi)星DNA的特異性引物。最終, 從中國倉鼠微衛(wèi)星富集DNA文庫中,分離鑒定了17個新的近交系中國倉鼠微衛(wèi)星位點并對其進行了分析。

理論上，采樣數(shù)越多，群體遺傳質(zhì)量檢測結(jié)果就越準確可靠[11]。但過多采樣，不僅浪費了人力物力、增加了檢測成本，還缺乏一定的可操作性。故本標準從實際出發(fā)，制定了每個群體至少抽樣30只個體進行檢測的標準。近交系數(shù)是評價近交系群體的關(guān)鍵指標，近交系數(shù)越接近100%近交系質(zhì)量越好；且近交系個體的基因型應(yīng)均為純合子，所有被測樣品檢測位點的等位基因都應(yīng)符合品系特征，沒有新的等位基因出現(xiàn)為合格的近交系中國倉鼠，否則判為不合格。

附錄1 (規(guī)范性附錄) ：

近交系中國倉鼠的微衛(wèi)星標記檢測方法

1 基因組DNA 的提取

用苯酚氯仿法或相應(yīng)的試劑盒提取近交系中國倉鼠的基因組DNA。檢測A260/A280值在1.8 左右的基因組DNA 進行后續(xù)試驗。

2 微衛(wèi)星位點

從附表1中隨機挑選10個微衛(wèi)星位點，對近交系中國倉鼠的遺傳質(zhì)量進行檢測。

3 PCR 擴增

3.1 PCR擴增體系 PCR反應(yīng)的總體積為10 μL：10 ng/mL 模板： 0.8 μL； 1pmol/L 上、下游引物： 各0.1 μL； 5 U/μL Taq DNA 聚合酶： 0.1 μL； 2.5 mmol/L dNTPs 0.7 μL； 25 mmol/L Mg2+： 0.8 μL； 10×Buffer 1.0 μL； dd H2O 6.4 μL。

3.2 PCR 擴增程序 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s； 退火(具體溫度見附表1)30 s； 72 ℃延伸45 s； 30 個循環(huán)后72 ℃延伸7 min。

3.3 PCR擴增產(chǎn)物檢測 PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后, 取3 μL擴增產(chǎn)物于2% 瓊脂糖凝膠中, 電泳檢測產(chǎn)物。

3.4 PCR擴增產(chǎn)物掃描 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，微衛(wèi)星引物標記的熒光種類是正向鏈的5’端藍色熒關(guān)標記(FAM), 內(nèi)參是GeneScanTM-500 LIZTM。取3～5 μL PCR 產(chǎn)物于384 孔板中，加入8 μL 含有內(nèi)標的Loading Buffer(去離子甲酰銨)，上機STR 掃描。

4 掃描結(jié)果及判定

一般合格的擴增產(chǎn)物，STR 掃描后經(jīng)Gene Marker V1.6判讀的結(jié)果有兩種： 一種為只有一條主波的純合子基因型； 另一種為含兩條主波的雜合子基因型。所有樣品檢測位點的等位基因都符合品系的特征，沒有新的等位基因出現(xiàn)為合格的近交系中國倉鼠； 否則判為不合格。

附表1 中國倉鼠部分微衛(wèi)星位點信息及引物擴增條件

5 結(jié)果報告

根據(jù)判定結(jié)果，對被測近交系中國倉鼠群體做出檢測報告。