王成舟

(1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院科研部, 杭州310009； 2. 浙江大學(xué), 杭州310029)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)模型是以結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，達(dá)到部分心肌組織因急性缺血缺氧導(dǎo)致心肌組織細(xì)胞死亡，類似人類AMI 臨床事件的模型特點(diǎn)。在動(dòng)物非臨床試驗(yàn)的心肌梗死模型中，常見以小鼠、大鼠、兔、貓、犬、小型豬為報(bào)道多見，隨著在低等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭腥〉玫某删?，越來越需要高等非人靈長類心肌梗死模型的出現(xiàn)。在非人靈長類動(dòng)物中食蟹猴較比獼猴以身體體型小、來源豐富、易于馴化等優(yōu)勢，也漸漸被研究科學(xué)工作者選定為理想的高等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｊ承泛?Macaca fascicularis), 是與人類最為接近的物種之一，在生理學(xué)、解剖學(xué)、免疫學(xué)以及神經(jīng)學(xué)等方面有很高的相似度，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域也是比較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用其建立的動(dòng)物模型被廣泛用于研究人類疾病,如在傳染病、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、生殖疾病、神經(jīng)疾病及眼疾病等方面，對比歐美發(fā)達(dá)國家，中國具有相當(dāng)豐富的靈長類動(dòng)物資源提供國內(nèi)外應(yīng)用[1]。用食蟹猴建立的人類疾病動(dòng)物模型有利于觀察疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，同時(shí)為治療藥物的療效檢驗(yàn)和醫(yī)學(xué)研究提供可靠的保證，而且，由于食蟹猴心臟解剖特點(diǎn)和生物學(xué)特性與人相似： 心臟體質(zhì)量比例大，冠狀血管粗大明顯, 手術(shù)操作容易, 心臟局部缺血耐受性強(qiáng)，心臟有較強(qiáng)的抗心律失常能力，因此食蟹猴是心肌缺血試驗(yàn)理想的動(dòng)物模型。然而，近年來食蟹猴心肌梗死模型的應(yīng)用雖然是一種趨勢，但是中文文獻(xiàn)報(bào)道不多，故此，結(jié)合浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院蕭山動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心制備食蟹猴AMI建模的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出其建模流程、護(hù)理方法及注意要點(diǎn)。

1 造模?方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)5～6 周歲，體質(zhì)量5～7 kg 雄性食蟹猴，由蘇州西山中科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(蘇)2012-0009]及廣西防城港常春生物技術(shù)開發(fā)有限公司[SCXK(桂)2013-0004]提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

食蟹猴飼養(yǎng)在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心普通環(huán)境中[SYXK(浙)2014-0004]。單籠飼養(yǎng), 飼養(yǎng)室溫度(21±3) ℃, 相對濕度55%±15%，猴維持飼料(由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供)一日二餐飼喂，中間一餐水果，實(shí)驗(yàn)過程給予常規(guī)護(hù)理和人道主義的關(guān)懷。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器與耗材

美國Cardell 公司動(dòng)物專用監(jiān)護(hù)儀、VME 動(dòng)物麻醉機(jī)、呼吸機(jī)(Matrx 3000)、威利高頻電刀、除顫儀(Philips, Heartstart XL)、電動(dòng)吸引器( 斯曼峰，Y X 9 3 0 D ) 、3 通道心電圖儀(MIDMARK?，導(dǎo)聯(lián))。

1.4 造模手術(shù)前處理

1.4.1 術(shù)前準(zhǔn)備 手術(shù)前列出清單, 逐一確認(rèn)手術(shù)藥品、急救藥品、器材、耗品符合實(shí)驗(yàn)的要求，打開氧氣瓶開關(guān)，確定氣壓表壓力，確認(rèn)氧氣瓶中氧氣是否充足，檢查麻醉揮發(fā)罐中的異氟烷藥物是否足夠?qū)嶒?yàn)的需要，檢查鈉石灰的顏色是否需要更換，檢查呼吸機(jī)氣路暢通而且無漏氣，手術(shù)臺(tái)鋪墊2 層一次性中單，整個(gè)手術(shù)室消毒液清掃后紫外燈過夜照射消毒。手術(shù)當(dāng)日提前打開手術(shù)臺(tái)溫控開關(guān)，調(diào)節(jié)手術(shù)臺(tái)溫度在39～40 ℃。

1.4.2 食蟹猴麻醉 在實(shí)驗(yàn)前挑選健康雄性成年食蟹猴，并稱量體質(zhì)量，計(jì)算手術(shù)前誘導(dǎo)麻醉給藥量。并在手術(shù)前12 h 開始禁水禁食。準(zhǔn)備手術(shù)的食蟹猴通過肌肉注射0.2 mg/kg 米達(dá)唑侖、0.04 mg/kg 硫酸阿托品注射液及5 mg/kg 鹽酸氯胺酮注射液誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜。

1.4.3 麻醉后處理 待試驗(yàn)猴進(jìn)入麻醉狀態(tài)后, 對手術(shù)部位(左胸部)、電刀電極負(fù)極貼片位(背腹部)及相應(yīng)的監(jiān)測與皮膚接觸部位進(jìn)行剃毛處理。在試驗(yàn)猴小腿隱靜脈安裝留置針保留靜脈滴注通路。80 萬單位青霉素1 支溶解于100 mL 生理鹽水中, 連接靜脈通路進(jìn)行滴注(保持在20滴/min左右), 同時(shí)配置2 μg/mL、5 μg/mL 腎上腺素備用。

1.5 手術(shù)造模

1.5.1 氣管插管 將食蟹猴四肢綁定在手術(shù)臺(tái)上，胸腔心臟部位正對無影燈最亮處，把2 顆上犬牙用繃帶固定在手術(shù)臺(tái)上沿，使食蟹猴頭、頸、軀干在一條直線上，用喉鏡葉片推開舌頭及托起會(huì)厭軟骨, 露出氣管入口, 根據(jù)食蟹猴體型大小選擇合適型號(hào)的氣管插管(食蟹猴一般選用型號(hào)： 3.5#、4.0#、4.5#)進(jìn)行插管，插管的頂端插到食蟹猴的肩部平行的位置, 插入之前大致對照下插入深度，插到位后, 充盈插管氣囊, 用絲線類輕物放置在氣管插管口，觀察到絲線隨呼吸氣流擺動(dòng)說明插管成功, 固定氣管插管, 接通氣管插管到呼吸機(jī)。

1.5.2 生命體征維持 打開氧氣瓶開關(guān)及壓力表開關(guān)，使壓力表輸出壓力保持在0.2～0.4 MPa，打開呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)潮氣量大小10 mL/kg，呼吸頻率25～30 次/ min，調(diào)節(jié)氧氣流量計(jì)1 L/min(按照5 kg 食蟹猴)，接上心電圖電極、血壓袖帶及血氧探頭進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(圖1)。先流通一段時(shí)間氧氣，待血氧濃度正常，再打開異氟烷揮發(fā)罐開度至2%～2.5%，在手術(shù)過程中時(shí)時(shí)觀察動(dòng)物生命體征(心率、血壓、血氧濃度、呼吸狀態(tài)、瞳孔反應(yīng)及對痛覺的反應(yīng))，避免麻醉過度。一般在手術(shù)后程揮發(fā)罐開度調(diào)至1%即可。

圖 1 監(jiān)護(hù)狀態(tài)的食蟹猴

1.5.3 AMI 手術(shù) 輔助人員接通高頻電刀，調(diào)節(jié)電刀功率電切(CUT)及電凝(COAG)功率15 W，在中單上倒入手術(shù)包、各型號(hào)線圈、一次性刀片、醫(yī)用紗布疊片、醫(yī)用棉簽。手術(shù)操作者及輔助助手穿上手術(shù)服、帽子、口罩、滅菌橡膠外科手套，利用聚維酮碘及消毒酒精對左胸部區(qū)域交替消毒與脫碘處理，食蟹猴身上再鋪1 層一次性中單，在手術(shù)部位把中單剪成圓形開口，露出手術(shù)部位，手術(shù)操作者于心臟體表左胸第4 肋處用電刀燒開皮膚層、肌肉層及肋骨肉層，露出心包，用擴(kuò)胸器擴(kuò)大所見心臟視野，用小剪刀小心剪開心包膜層，用帕巾鉗把心包膜與肋骨肉層夾一起，用生理鹽水浸濕的醫(yī)用疊片墊在心臟四周, 找到左冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending coronary artery, LAD), 用醫(yī)用棉簽固定搏動(dòng)中的心臟, 在第一對角支和第二對角支之間用5-0 prolene線縫針掌握好進(jìn)針深度及進(jìn)針寬度連續(xù)縫合2 針，待心動(dòng)周期及心電周期正常后收線打結(jié), 以達(dá)到梗死心尖前壁及心尖心肌。術(shù)中觀察到心尖心肌變白及心電圖ST 段抬高作為成功標(biāo)志(圖2、圖3)。

結(jié)束后, 用醫(yī)用紗布疊片吸凈胸腔內(nèi)血水滲出物，用醫(yī)用棉簽清理盡所有心臟部位紗布疊片，復(fù)原肺及心臟在胸腔的位置后，用2-0 或3-0 縫線分別對肋骨層、肌肉層、皮膚層逐層縫合，皮膚層用棱形縫合針，其他層用圓形縫合針。關(guān)肋骨層時(shí)用氣囊膨肺，防止氣胸出現(xiàn)。

1.5.4 關(guān)閉胸腔后處理 關(guān)掉麻醉藥揮發(fā)罐開度,仍保持食蟹猴在插管狀態(tài)下呼吸氧氣，每只術(shù)后食蟹猴注射0.5 mL鹽酸嗎啡注射液。待食蟹猴完全清醒，生命體征(血壓、心率、血氧濃度、呼吸)平穩(wěn)后歸籠，在籠中盡量側(cè)臥并且臉向籠門便于觀察。

圖 2 結(jié)扎LAD 后的心臟

圖 3 食蟹猴心梗前后Ⅱ?qū)?lián)心電對比圖

2 護(hù)理

2.1 術(shù)中護(hù)理

AMI食蟹猴易發(fā)生室顫(ventricular fibrillation，VF)、心率失常及心臟驟停意外情況。電擊除顫是VF治療最有效的方法，隨VF時(shí)間的延長除顫效果急劇下降[2]，叩擊胸部，電極與皮膚間使用鹽水紗布接觸，要迅速準(zhǔn)確地電擊除顫，除顫儀能量調(diào)至7～10 J； 反復(fù)VF 除了電擊除顫，還要合并使用腎上腺素、胺碘酮、利多卡因，小劑量開始給予，反復(fù)多次，逐漸加大劑量，直至心電恢復(fù)正常。心率失常處理： 鹽酸利多卡因注射液, 局麻藥, 常直接用在手術(shù)傷口, 主要浸潤麻醉, 1.5 mg/kg 靜脈治療AMI 后室性早博和室性心動(dòng)過速； 鹽酸胺碘酮注射液，胺碘酮的藥用作用能有效降低AMI 時(shí)伴有快速心率失常的發(fā)生率，可作為AMI時(shí)發(fā)生心率失常的首選藥物，胺碘酮提高心室電穩(wěn)定及異位搏動(dòng)的作用, 能提高心肌的VF 閾值[3], 靜脈給予最大用量不超過30 mg。心衰處理： 呋塞米注射液20 mg靜脈給予強(qiáng)心利尿治療, 合并使用濃度5% NaHCO3注射液一次性推入5 mL 防止因缺氧帶來的酸中毒。心臟驟停處理：心肺復(fù)蘇(CardioPulmonary Resuscitation，CPR)同時(shí)靜脈給予0.25～0.5 mg 鹽酸腎上腺素靜脈給予。在CPR 過程中復(fù)蘇效果不佳時(shí)，要拆線開胸直接按壓心臟，盡可能不要放棄, 根據(jù)急救時(shí)間與急救效果判斷有時(shí)要果斷松開結(jié)扎點(diǎn), 放棄造模, 以救活動(dòng)物為主。在手術(shù)監(jiān)護(hù)過程中經(jīng)常測量食蟹猴血壓和心率，當(dāng)血壓或心率持續(xù)下降時(shí),要經(jīng)靜脈通道給予2～5 μg/mL 的腎上腺素滴注。

2.2 術(shù)后護(hù)理

2.2.1 食蟹猴的籠前觀察 行為是食蟹猴喜怒哀樂的表達(dá)，只有通過日常細(xì)心觀察才能掌握食蟹猴健康狀況的第一手資料，如： 自我蜷縮，說明體虛畏寒；不敢對眼，害怕畏懼； 不能坐立或攀爬，匍匐籠中說明病痛不輕等等。而且，籠前觀察是食蟹猴術(shù)后護(hù)理的關(guān)鍵步驟，如攝食量、大便和小便情況、底盤中是否發(fā)現(xiàn)拉稀便和嘔吐物等，了解狀況及需求才能對癥護(hù)理，并記錄下這些異常行為及時(shí)與獸醫(yī)商量緩解辦法，如是否繼續(xù)給予鹽酸嗎啡用來減輕痛苦等。而且，建模后發(fā)生VF 時(shí)第一時(shí)間沒有得到急救處理，會(huì)威脅食蟹猴的生命，前期努力工作成果也將失去，而且，缺少重要的數(shù)據(jù)資料也影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度及結(jié)果。一般在心肌梗死手術(shù)后3 d 內(nèi)是食蟹猴轉(zhuǎn)危為安的適應(yīng)期，度過適應(yīng)期后的康復(fù)一般不會(huì)有大的生命危險(xiǎn)。

2.2.2 體溫維持 由于麻醉藥的作用，手術(shù)中食蟹猴的心率明顯降低，機(jī)體處于放松狀態(tài)，基礎(chǔ)代謝處于低水平，從而導(dǎo)致食蟹猴低體溫現(xiàn)象，而且，開胸手術(shù)及心肌梗死造成心臟正常的動(dòng)力提供下降，造成心射血能力的不足使供血不足，雙重作用使處于手術(shù)期的食蟹猴體溫偏低。低體溫會(huì)帶來抗傷口感染力降低、蘇醒延遲、機(jī)體缺氧導(dǎo)致酸中毒、也可能誘發(fā)低溫式VF、胃腸功能減退等。術(shù)后經(jīng)?？捎^察到食蟹猴臉色蒼白、口腔黏膜色淡、身體緊縮，行動(dòng)緩慢，表情空虛、呆滯及畏寒等表現(xiàn)，甚至出現(xiàn)低體溫疾病反應(yīng)。所以，術(shù)中及術(shù)后護(hù)理中必須保持食蟹猴體溫的正常水平，如在術(shù)中利用溫控手術(shù)臺(tái)設(shè)置臺(tái)面溫度高出食蟹猴正常體溫及手術(shù)臺(tái)面用雙層中單保溫；術(shù)后食蟹猴單間飼養(yǎng)，飼養(yǎng)間溫度適當(dāng)高于其他飼養(yǎng)間(維持在25～28 ℃)，體虛的食蟹猴可以在金屬鐵絲籠上墊毛巾隔冷保溫，也可在籠前放置取暖器增暖保溫； 有時(shí)由于體虛原因可能出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等癥狀，要及時(shí)清理干凈口腔及呼吸道、肛門等處，保持干凈清潔。

2.2.3 防止感染 術(shù)后前幾日每日對外科手術(shù)傷口給予聚維酮碘清創(chuàng), 術(shù)后前3 d每日2次(早、晚)80 萬單位注射用青霉素鈉肌肉內(nèi)注射預(yù)防感染，傷口愈合不佳或伴隨其他炎癥癥狀時(shí)，可延長1～2 d 使用青霉素鈉。對是否安裝植入子或食蟹猴是否撕拉縫合線等情況，必要時(shí)還要穿上透氣性好的防撕咬馬甲以防護(hù)傷口被破壞，傷口愈合好后(一般術(shù)后7～10 d)表皮縫合線及時(shí)拆去，以傷口白凈及干燥結(jié)痂為好，謹(jǐn)防紅腫、開裂及皮膚深層膿腫的存在。發(fā)現(xiàn)食蟹猴手術(shù)傷口開裂，應(yīng)及時(shí)縫合修復(fù)完整傷口開裂處。

2.2.4 必要的營養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)充 術(shù)后營養(yǎng)補(bǔ)充是術(shù)后康復(fù)的根本。術(shù)后食蟹猴可以開始少量進(jìn)食，循序漸進(jìn)加大到日標(biāo)準(zhǔn)量，每日要記錄進(jìn)食量以便了解每只食蟹猴的每日飼料攝入量。在食蟹猴痛苦而不愿意飲食時(shí)，要多花心思滿足它營養(yǎng)物質(zhì)的攝入以維持機(jī)體基礎(chǔ)代謝及康復(fù)的需要，這就要求管理工作人員細(xì)心觀察記錄食蟹猴的術(shù)后飲食情況。食蟹猴無進(jìn)食欲望、飼料剩余量多、甚至水果也不吃的情況下，要豐富給食水果品種，要不怕麻煩少量多次給食。對完全不進(jìn)食的食蟹猴要及時(shí)靜脈滴注補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，或者經(jīng)口腔灌胃補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，如牛奶、糖鹽水等。

2.3 注意事項(xiàng)

使用鹽酸氯胺酮后食蟹猴的唾液腺分泌明顯,使用前10 min一般用抗膽堿藥如硫酸阿托品注射液肌肉內(nèi)注射，以減少腺體分泌，防止分泌物反流回肺, 降低麻醉風(fēng)險(xiǎn)。在實(shí)驗(yàn)過程中，如口腔出現(xiàn)大量唾液時(shí), 應(yīng)及時(shí)使用電動(dòng)式吸引器吸盡。

心外科手術(shù)需要準(zhǔn)備的物品較多，手術(shù)過程中出現(xiàn)意外情況也復(fù)雜，臨時(shí)搶救處理需要物品較急，在手術(shù)前實(shí)驗(yàn)室管理工作人員要清點(diǎn)術(shù)中所需物品，并分類擺放，急救藥品集中放置在專用框中，放置在救護(hù)人員可見范圍之內(nèi)。為方便急救給藥，在輸液器與留置針之間接上醫(yī)用輸液三通，在手術(shù)過程中除顫儀及電動(dòng)吸引器隨時(shí)處于待機(jī)狀態(tài)。

手術(shù)完成后，食蟹猴不能行動(dòng)前，不要拔掉氣管插管，讓食蟹猴多吸氧氣；在歸籠前，不要拔掉靜脈留置針，防止發(fā)生VF、心率失常及猝死時(shí)急救給藥需要。

3 結(jié)果

大動(dòng)物基地在2014～2018年一共制作174例AMI 模型，其中3 例在AMI后出現(xiàn)心衰導(dǎo)致心臟驟停時(shí)，松開結(jié)扎點(diǎn)放棄繼續(xù)實(shí)驗(yàn)； 4 例術(shù)中死亡； 14 例術(shù)后1 d 內(nèi)死亡； 4 例術(shù)后2 d 內(nèi)死亡；3例術(shù)后3 d 內(nèi)死亡。

4 討論

AMI 造模是研究心肌缺血損傷公認(rèn)的模型。結(jié)扎法制作的動(dòng)物模型AMI 范圍較為清楚、確切、快速形成且易于復(fù)制，還可根據(jù)研究需要對心臟不同區(qū)域進(jìn)行造模[4]。AMI 建模過程最為關(guān)鍵是開胸外科手術(shù)，胸外科手術(shù)操作要求手術(shù)人員與輔助人員之間密切配合，熟練造模技術(shù)人員能夠根據(jù)要求控制AMI 范圍的大小，還能夠與麻醉人員互動(dòng)配合掌握術(shù)中食蟹猴的實(shí)時(shí)狀況及應(yīng)對策略。

在AMI 的建模過程中，VF 是最常見的突發(fā)事件，VF 是最為危險(xiǎn)的心率失常，電極除顫是最有效最直接的方法，及時(shí)發(fā)現(xiàn)VF、及時(shí)成功除顫是建模成功的另一關(guān)鍵因素。劉興利[5]利用雜種犬對LAD 實(shí)施結(jié)扎，在30 min 內(nèi)3/10 的結(jié)扎犬發(fā)生了VF，并認(rèn)為AMI 時(shí)，缺血心肌與非缺血心肌電生理性質(zhì)的改變是VF 形成的原因。有報(bào)道[6]，小型豬LAD 結(jié)扎位點(diǎn)過高是AMI后發(fā)生VF 的危險(xiǎn)因素。有研究[7]表明，早期急性心肌缺血伴隨大量的去甲腎上腺素(noradrenaline, NE)釋放與積聚，局部缺血心肌在NE 的作用下表現(xiàn)為VF，而且，NE 的釋放和積聚與在AMI后10～40 min 內(nèi)成正向增加，隨后遞減。因此，在AMI早期階段對VF 的及時(shí)發(fā)現(xiàn)，及合理應(yīng)對與排除是建模成功不可忽視的因素。

動(dòng)物存活狀況除了與手術(shù)建模成功與否外，還與手術(shù)后的護(hù)理密切相關(guān)。建模動(dòng)物由一個(gè)健康的個(gè)體，突然變成一個(gè)疾病模型，其中各種病態(tài)反應(yīng)及各種相關(guān)的動(dòng)物感受反應(yīng)前后相差巨大,這就要求動(dòng)物管理人員對建模后的動(dòng)物進(jìn)行各種有針對性看護(hù)與救助, AMI建模特別要注意每日的籠前觀察, 并做好記錄, 注意飲食情況、防受涼,防拉稀、防感染及必要的營養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)充等。

該造模方法是在前降支第一對角支與第二對角支之間實(shí)施結(jié)扎，這是AMI造模常見的結(jié)扎位點(diǎn)。也有研究[8]認(rèn)為結(jié)扎LAD 阻斷血流75 %, 模型既可以真實(shí)反應(yīng)冠狀動(dòng)脈疾病病變模式，而且能夠保證AMI動(dòng)物的存活率，能夠有足夠的模型動(dòng)物供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，模型動(dòng)物是安全有效的。當(dāng)然，也有模型動(dòng)物回旋支及對角支供血豐富，能對前降支缺血區(qū)域及時(shí)補(bǔ)充血液，僅僅結(jié)扎LAD仍不能達(dá)到模型需求，可以對回旋支及對角支遠(yuǎn)端進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎時(shí)參考實(shí)時(shí)心電圖及AMI 狀態(tài)。

本文是近幾年內(nèi)食蟹猴AMI建模經(jīng)驗(yàn)，可為相關(guān)科研人員提供參考。