李勇勝，藺永和，楊 琴，劉 權

（蘭州大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 / 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 /蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020）

紅三葉(Trifolium pratense)，又名紅車軸草、紅花苜蓿等，是一種分布范圍廣的優(yōu)良豆科牧草[1]。紅三葉中含有大量異黃酮類化合物[2]，具有良好的抗氧化、清除自由基活性，可用作治療百日咳、哮喘、濕疹、眼部疾病、癌癥、鎮(zhèn)痙、祛痰、止痛[3]等病癥，常作為功能食品或膳食補充劑[4-5]。作為少數(shù)幾種富含植物雌激素的植物，越來越多地應用于臨床中改善和治療婦女更年期綜合癥，以及預防骨質(zhì)疏松、乳腺癌、心血管系統(tǒng)疾病等。由于植物藥毒性低、靶點多、不易產(chǎn)生抗藥性等眾多優(yōu)點，紅三葉提取物已被制成多種劑型，其銷量在美國多年來一直名列植物藥的前10位[6]。此外，紅三葉異黃酮對其他植物生長具有明顯的抑制作用，是該植物抗逆和種群競爭的物質(zhì)基礎[7-8]，具有重要的生態(tài)功能。

異黃酮含量是紅三葉育種、種植管理及提取和純化工藝優(yōu)化等過程的重要指標。目前測定方法主要為紫外分光光度法和高效液相色譜法[9-11]。兩種方法都是利用異黃酮化合物紫外吸收的原理，但測定方法差別較大，適用范圍不盡相同。高效液相色譜法精確度高，可以測定單個異黃酮化合物的含量，但需要標準品較多，操作繁雜，耗時長，測試成本高，多用于異黃酮單個組分的精確分析[9,12-13]。用高效液相色譜法也可以測定紅三葉異黃酮的總含量，但往往只是其中部分異黃酮成分含量的總和，存在較大的系統(tǒng)誤差。生產(chǎn)實踐中，常常需要對紅三葉異黃酮總量進行定量。目前已經(jīng)報道的紅三葉異黃酮有40多種[14]，仍存在一些未知的組分。紫外分光光度法對標準品數(shù)量要求較低，一般1～2個就可以，速度快，靈敏度高，測試成本低，特別適合大量樣品定量、半定量的測定，在異黃酮的研發(fā)中有大量應用[14-17]。對于紫外分光光度法而言，影響其測定精度的主要因素有測定波長、溶劑以及標準品的選擇[15]。為了不斷提高紅三葉異黃酮含量測定精度，很多學者開展了大量的研究工作：陳寒青和金征宇[16]建立了三波長紫外分光光度法，張曉松等[15]采用等吸光點紫外分光光度法。然而這些方法都需要建立在標準品的科學選擇上，標準品的選擇同時也會改變測定波長等其他因素。

圖1 紅三葉中4種主要異黃酮成分Figure 1 Four isoflavone compounds in red clover

紅三葉異黃酮中含量較高的主要是芒柄花素(formononetin，以下簡稱F)、鷹嘴豆素A (biochanin A，以下簡稱B)、染料木素(genistein，以下簡稱G)和大豆苷元(daidzein，以下簡稱D) 4種異黃酮成分[9-14](圖1)。目前，利用紫外分光光度法對紅三葉中異黃酮的含量進行標定和檢測中多采用1種標準品，以鷹嘴豆芽素A[11,16,18-23]、芒柄花素[14,24-26]、大豆苷元[27-28]或染料木素作為標準品[29]。有少數(shù)研究采用2種標準品進行標定，例如用芒柄花素和鷹嘴豆素A組合[15]，用大豆苷元和染料木素組合作為標準品[30]。還有學者用蘆丁作為標準品進行測定[6]。但是關于紅三葉異黃酮含量測定的標準品如何選擇及所帶來的誤差鮮見報道。因此，本研究將4種異黃酮成分作為標準品，分別在240、249、254、260和275 nm對紅三葉材料進行測定，并分析測定結(jié)果，以期為建立更準確的紅三葉異黃酮檢測方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：2017年7月初采自甘肅省岷縣種植的紅三葉的地上部分，分別命名為樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。

試劑：鷹嘴豆素A標準品(含量 ≥ 98%)、芒柄花素標準品 (含量 ≥ 98%)、染料木素 (含量 ≥ 98%)、大豆苷元標準品(含量 ≥ 98%)、甲醇(色譜級)均購于北京伊諾凱科技有限公司。

設備：UV-1600型紫外可見分光光度計(日本島津)。

1.2 方法

1.2.1 紅三葉樣品待測液的制備

稱取植物樣品0.20 g，加入8 mL甲醇，超聲提取30 min。提取液4 000 r·min-1離心10 min后，取上清液，通過0.45 μm有機膜過濾，制備待測液。將樣品I～V每個樣品重復提取3次。

1.2.2 紫外吸收分光光度法

分別準確稱取芒柄花素、鷹嘴豆素A、染料木素和大豆苷元標準品，置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，然后依次稀釋，得到一系列標準品溶液，然后在波長為190～600 nm的波長范圍內(nèi)進行光譜掃描。芒柄花素和大豆苷元在249 nm處有最大吸收，染料木素在259 nm處有最大吸收，鷹嘴豆素A和紅三葉樣品待測液的最大吸收值在261 nm (圖2)。本研究分別選擇240、249、254、260和275 nm作為測定波長。

以甲醇為空白對照，分別于240、249、254、260和275 nm波長處測定吸收值，繪制標準曲線并計算線性回歸方程，計算紅三葉異黃酮含量。

鷹嘴豆素A：Y240= 59.902X+ 0.204 2 (R2= 0.998 2)；Y249= 92.871X+ 0.205 5 (R2= 0.999 3)；Y254= 118.17X+0.205 4 (R2= 0.999 7)；Y260= 140.55X+ 0.206 8 (R2=0.999 9)；Y275= 71.516X+ 0.210 3 (R2= 0.999 6)。

大豆苷元：Y240= 103.44X+ 0.223 3 (R2= 0.999 5)；Y249= 114.13X+ 0.221 9 (R2= 0.999 9)；Y254= 104.71X+0.224 9 (R2= 0.999 7)；Y260= 102.27X+ 0.222 3 (R2=0.999 9)；Y275= 65.761X+ 0.222 2 (R2= 0.999 7)。

芒柄花素：Y240= 103.1X+ 0.202 3 (R2= 0.999 7)；Y249= 112.42X+ 0.205 1 (R2= 0.999 7)；Y254= 105.95X+0.206 2 (R2= 0.999 7)；Y260= 100.15X+ 0.208 4 (R2=0.999 8)；Y275= 61.955X+ 0.209 9 (R2= 0.999 7)。

染料木素：Y240= 59.315X+ 0.213 8 (R2= 0.999 2)；Y249= 93.256X+ 0.212 6 (R2= 0.999 7)；Y254= 118.53X+0.212 3 (R2= 0.999 7)；Y260= 142.71X+ 0.212 5 (R2=0.999 9)；Y275= 71.06X+ 0.215 9 (R2= 0.999 7)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件分別對同一樣品不同標準品所測定的異黃酮含量進行單因素方差分析，并用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較；利用Excel 2007制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅三葉異黃酮的紫外分光光度法分析結(jié)果

即使是用同一種標準品，紅三葉提取物在240、249、254、260和275 nm測定的結(jié)果也相差非常大(表1)。根據(jù)其化學結(jié)構(取代基數(shù)量和位置)和紫外吸收曲線，紅三葉的4種主要異黃酮成分可以分為兩組：FD組為芒柄花素和大豆苷元，BG組為鷹嘴豆素A和染料木素(圖1、圖2)。

在波長 ≤ 249 nm時，BG組測定的含量高于FD組(表1)。在240 nm處，標準品B和G的紫外吸收曲線處于波谷位置，特別是標準品B，吸收強度低，導致測定結(jié)果偏高，也說明波長對測定結(jié)果的影響較大(表1)。在254 nm下，所測定的異黃酮含量濃度從大到小依次為 F ＞ D ＞ B ＞ G，這與 240和249 nm規(guī)律不一致，F(xiàn)和D之間、B和G之間差距較小，但兩組之間數(shù)值差距較大(表1)；260 nm的變化規(guī)律與254 nm基本一致，但FD組測定的含量高于254 nm，BG組含量低于254 nm，組間差距較254 nm增大(表1)；275 nm的變化規(guī)律與254、260 nm的相同，但是D、B和G這3種標準品測定的含量之間差值較小(表1)。這是由于同濃度的D、mg·g-1B和G的紫外吸收曲線在275 nm處有交叉，吸收強度接近，而F在此處吸收強度相對較弱，故測得的含量較高。在本研究選定的5個波長下，組內(nèi)B測定的含量大多高于G，F(xiàn)測定的含量大于D，但同組內(nèi)沒有顯著性差異。波長大于等于249 nm時，同一標準品所測得紅三葉異黃酮含量大多在275 nm處是最高值。

表1 不同標準品所標定的紅三葉異黃酮含量Table 1 Isoflavone content in red clover extracts by using different standards

此外，同一個紅三葉樣品，不同波長或不同標準品進行標定的含量差異非常大。例如樣品Ⅱ的含量最低為10.23 mg·g-1(260 nm下，染料木素為標準品)，最高為17.07 mg·g-1(275 nm下，芒柄花素為標準品)。但是，如果只是比較含量的相對大小，則不同波長或不同標準品，對含量高低排序影響不大。5個樣品中異黃酮含量順序均為樣品Ⅴ ＞ 樣品Ⅱ ＞樣品Ⅰ ＞ 樣品Ⅲ ＞ 樣品Ⅳ。

3 討論

異黃酮是紅三葉植物主要的次生代謝物，具有重要生態(tài)功能與藥用價值。異黃酮含量的準確測定對于該植物的研究和應用都非常重要。生產(chǎn)實踐中，分光光度法是對該植物異黃酮總含量測定的主要方法之一，被廣泛采用。本研究表明，不同波長和標準品對異黃酮含量測定影響非常顯著，然而這在之前卻未見報道。

根據(jù)含量測定結(jié)果，作為含量檢測標準品的4種主要異黃酮化合物大體可分為兩組：FD組和BG組。組內(nèi)差異較小，組間差異較大(表1)。雖然4個化合物骨架均為黃酮結(jié)構，但F和D為7位羥基和4'位氧取代的結(jié)構，而B和G位為5、7位羥基和4'位氧取代的結(jié)構(圖1)。這也解釋了組內(nèi)紫外吸收曲線相似度較高，測定含量較為接近的原因。

據(jù)文獻報道，很多波長均被應用到紅三葉異黃酮的檢測中[15-16,18-29]，但未見對其所引起的誤差進行比較研究和報道。通過觀察紫外吸收曲線，4個標準品化合物和紅三葉提取物在275 nm處有交叉，吸收強度差距小，而且曲線斜率也較為接近(圖2)。在275 nm處比較不同標準品的測定準確度更為科學合理。在275 nm所處得到的結(jié)果中，標準品F測定含量較高。特別是樣品Ⅰ和Ⅴ，F(xiàn)所測定含量與其他標準品差異顯著(P＜ 0.05)?；诒狙芯拷Y(jié)果，建議利用B或G為標準品，在275 nm處測定紅三葉異黃酮含量更為準確，兩個化合物測定結(jié)果數(shù)值接近，且無顯著差異(表1)。然而關于用B或G，還是混合使用的標準品使用方法，還需要進一步的深入研究和探討，特別是需要大樣本的積累。本研究結(jié)果可以為測定異黃酮含量時提供一個較為理想的參考初始值，雖不能給出一個精確的測定方案，但將有助于提高總異黃酮含量測定的準確度，而且希望通過本研究引起學界對標準品和波長選擇所帶來系統(tǒng)誤差的重視。

一般認為，利用植物體內(nèi)含量較高的成分作為標準品進行表征，會提高紫外分光光度法的測定精度。紅三葉異黃酮含量會因生長環(huán)境、生理階段、采集部位甚至是樣品處理方式的不同引起其中成分與含量的變化[3,10,12-13,18]，同一種異黃酮成分在不同紅三葉樣品中的含量不同，同一個植物樣品中不同異黃酮成分含量也有差異，本研究結(jié)果中，利用不同化合物作為標準品，均未改變樣品異黃酮含量的大小關系。標準品在植物的含量高低，與所測定結(jié)果關系并不密切。此外，本研究發(fā)現(xiàn)不同波長對半定量或定性比較異黃酮含量影響也較小。因此雖然不同文獻中不同測定方法得到的紅三葉異黃酮含量的絕對值，直接進行比較可能存在一定誤差。但是本研究利用不同波長和標準品對紅三葉異黃酮含量的排序卻是可靠的，所得到的結(jié)論及優(yōu)化的提取純化工藝等是可行的[20,25,27]。