馬甜甜，羅東文，JAHUFER Mohamed zain zulfiqhar，駱 凱，李 潔，張吉宇

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2. 新西蘭國家草地農(nóng)業(yè)研究所，新西蘭 11008）

植物育種是一門綜合性學(xué)科，改良植物各性狀以取得良好的生態(tài)或經(jīng)濟(jì)效益。育種研究的過程中，從種質(zhì)資源的鑒定到新品種評(píng)價(jià)，涉及數(shù)量遺傳學(xué)原理、基因型與環(huán)境的互作、育種策略的選擇等方面。育種周期長，步驟復(fù)雜，從而產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)既是育種工作的基礎(chǔ)，也是育種手段的體現(xiàn)，更是檢驗(yàn)育種成果的重要途徑，因此對(duì)育種數(shù)據(jù)的分析顯得格外重要。

目前大多數(shù)育種者選用Excel、SPSS和GenStat進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Excel作為一款辦公軟件，具有數(shù)據(jù)處理、圖表可視化和初步統(tǒng)計(jì)分析等豐富的功能[1]，但在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)信息量少且操作繁瑣[2]。SPSS是較為權(quán)威的統(tǒng)計(jì)分析軟件，廣泛應(yīng)用于各類研究中[3-4]，具有操作簡便、易學(xué)易用等優(yōu)點(diǎn)，但是SPSS圖表可視化效果不明顯，而且更側(cè)重于商業(yè)和社會(huì)學(xué)研究領(lǐng)域。GenStat是由VSNi開發(fā)的商用統(tǒng)計(jì)分析軟件，歷史悠久并且不斷更新，始終活躍在生物統(tǒng)計(jì)學(xué)技術(shù)的前沿[5]，統(tǒng)計(jì)功能強(qiáng)大，但是更側(cè)重于農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域，且需購買軟件。

北京中農(nóng)博思科技發(fā)展有限公司基于“育種數(shù)據(jù)管理第一重要”的育種理念開發(fā)了農(nóng)博士育種家軟件，用于育種數(shù)據(jù)采集、管理和分析[6]，但推廣范圍有限，沒有得到很好的應(yīng)用。國外也有許多基于數(shù)量遺傳學(xué)原理的軟件為育種者提供育種策略選擇等方面的幫助。例如，QU-GENE[7]和在其基礎(chǔ)上建立的QuLine(又稱QuCim)[8-9]，模擬育種過程，提出最佳親本選配、雜交和后代選擇策略，從而提高育種效率；AlphaSim，模擬動(dòng)植物育種計(jì)劃，允許用戶模擬多種性狀和多種環(huán)境進(jìn)行基因組預(yù)測，應(yīng)用最佳選擇[10]；還有免費(fèi)軟件Selegen-REML/BLUP，可以用于估計(jì)方差分量、遺傳加性模型和遺傳增益[11]。但它們都不能為植物育種者提供完備的統(tǒng)計(jì)服務(wù)。

本文介紹一款專為植物育種工作者設(shè)計(jì)的免費(fèi)統(tǒng)計(jì)分析軟件DeltaGen(http://agrubuntu.cloudapp.net/PlantBreedingTool/)。DeltaGen是由新西蘭國家草地農(nóng)業(yè)研究所Zulfi Jahufer和羅東文基于R語言shiny包開發(fā)的一款分析工具。DeltaGen基于數(shù)量遺傳學(xué)原理，可以為育種者提供從試驗(yàn)設(shè)計(jì)到數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、統(tǒng)計(jì)和數(shù)量遺傳分析、選擇策略評(píng)估、模擬和成本評(píng)估、模式分析、指數(shù)選擇，直至生成研究報(bào)告的所有過程[12]。其簡便易學(xué)，步驟清晰，免費(fèi)向用戶開放使用，是一款非常實(shí)用的植物育種綜合分析和教學(xué)工具。

此外，DeltaGen生成的圖表都可以在界面上調(diào)整顏色和字體大小，進(jìn)行圖表美化，選擇顯示生成圖表的數(shù)據(jù)處理過程概述，下載圖表。DeltaGen是一款面向用戶的開源軟件，可隨時(shí)根據(jù)用戶的使用體驗(yàn)，合理要求以及分析方法的發(fā)展進(jìn)行更新優(yōu)化。

1 DeltaGen的主要功能

打開DeltaGen網(wǎng)址，啟動(dòng)網(wǎng)頁服務(wù)端可以得到圖1所示的用戶界面示意圖。

DeltaGen用戶界面的一級(jí)菜單有介紹(Introduction)、試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Trial Design)、數(shù)據(jù)輸入(Data Input)、圖表(Graphs and Tables)、模型(Models)、模式分析(Pattern Analysis)、保存和退出(Save & Quit)、幫助(Help)和致謝(Acknowledgements)欄。

1.1 介紹(Introduction)

DeltaGen簡介及軟件所屬的科研項(xiàng)目和資助情況。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Trial Design)

可以根據(jù)用戶需求進(jìn)行田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)類型有完全隨機(jī)設(shè)計(jì)(Completely Randomized)、完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)(Randomized Completely Block)、因子設(shè)計(jì)(Factorial)和行列設(shè)計(jì)(Row and Column)，設(shè)計(jì)結(jié)果可以生成電子版田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖和數(shù)據(jù)表格并下載保存。

1.3 數(shù)據(jù)輸入(Data Input)

DeltaGen輸入數(shù)據(jù)可以選擇自帶舉例數(shù)據(jù)(Examples)、上傳(Upload)或粘貼(Clipboard)。一般選擇上傳選項(xiàng)，DeltaGen上傳數(shù)據(jù)為CSV格式數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)中的缺失值可以用空格“ ”，星號(hào)“*”或點(diǎn)“.”表示，在數(shù)據(jù)上傳時(shí)界面的缺失數(shù)據(jù)(Missing value shown as)可以相應(yīng)選擇 Empty(代表空格)、Dot(代表.)或者*，點(diǎn)擊“Run”數(shù)據(jù)上傳完成。接下來必須對(duì)變量進(jìn)行重新命名，這一步驟非常重要，首先，它設(shè)定了育種試驗(yàn)的結(jié)構(gòu)為Year/Season/Location/Replicates/(Row+Column)/Sample+Check+Line，其次，后續(xù)的相關(guān)分析(單變量分析中的混合效應(yīng)線性模型，模式分析，選擇指數(shù))都是基于這個(gè)結(jié)構(gòu)展開的。同時(shí)注意在這一步驟中，不僅重新命名了變量，也改變了變量的性質(zhì)為因子(factor)。

圖1 DeltaGen用戶界面示意圖Figure 1 The DeltaGen user interface

1.4 圖表(Graphs and Tables)

基于輸入的數(shù)據(jù)，選擇plot進(jìn)入作圖，圖的類型(Plot-type)有直方圖(Histogram)、密度圖(Density)、散點(diǎn)圖(Scatter)、線形圖(Line)、條形圖(Bar)和箱線圖(Box-plot)，選擇Pivot Table進(jìn)入數(shù)據(jù)透視表界面。通過作圖和表格，可以檢驗(yàn)原始數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，發(fā)現(xiàn)缺省值和異常值，以及數(shù)據(jù)間的關(guān)系。

1.5 模型(Models)

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的特征和試驗(yàn)的目的選擇單變量分析(Univariate)或多變量分析(Multivariate)。

單變量分析用混合效應(yīng)線性模型(Linear Mixed Effects Model)處理重復(fù)測量數(shù)據(jù)，針對(duì)處理效應(yīng)是隨機(jī)效應(yīng)(Random terms)或固定效應(yīng)(Fixed terms)，基于所用混合效應(yīng)線性模型分別生成測量數(shù)據(jù)均值的最佳線性無偏估計(jì)(Best linear unbiased estimation，BLUE)值或最佳線性無偏預(yù)測(Best linear unbiased prediction，BLUP)值，以去除田間試驗(yàn)中環(huán)境對(duì)表型的影響。擬合混合效應(yīng)線性模型后還應(yīng)注意檢查殘差圖(Residual Plots)，如果殘差圖顯示模型的假設(shè)要求未被滿足(如原始數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布)，可能需要對(duì)響應(yīng)變量進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換(Data transformation)，可以選擇對(duì)數(shù)函數(shù)轉(zhuǎn)換(log_e)、平方根轉(zhuǎn)換(sqrt)和反三角函數(shù)轉(zhuǎn)換(arcsin)。對(duì)于兩個(gè)變量交互作用的隨機(jī)效應(yīng)，還可以進(jìn)行聚類分析(Cluster)和主成分分析(PCA)。此外在擬合混合效應(yīng)線性模型后，點(diǎn)擊遺傳增益和模擬(Genetic Gain and Simulation)，程序會(huì)自動(dòng)提取擬合結(jié)果中的相關(guān)信息，計(jì)算選擇周期中各性狀遺傳增益，模擬育種過程并計(jì)算育種成本。

多變量分析可進(jìn)行繪圖(Plot)、多變量方差分析(MANOVA)和選擇指數(shù)(Selection Index)選項(xiàng)，可以作主成分分析散點(diǎn)圖(Biplot)和多重相關(guān)圖(Matrix Plot)、多變量方差分析和Smith-Hazel選擇指數(shù)，計(jì)算各個(gè)體的指數(shù)值，依據(jù)指數(shù)值選擇留種或淘汰。

模式分析(Pattern Analysis)。在模式分析中基于去除了環(huán)境影響之后的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)(缺省選項(xiàng))可以進(jìn)行聚類分析(Cluster Analysis)和生成熱圖(Heatmap plot)，也可以進(jìn)行主成分分析生成主成分分析散點(diǎn)圖(PCA Biplot)。

1.6 保存和退出(Save & Quit)

按Download下載數(shù)據(jù)分析報(bào)告，按Quit App離開應(yīng)用。

1.7 幫助(Help)

DeltaGen有兩個(gè)幫助選項(xiàng)。一個(gè)是主菜單欄上的DeltaGen快速使用指導(dǎo)，和關(guān)于網(wǎng)頁服務(wù)端的開發(fā)者信息。一個(gè)是在每個(gè)數(shù)據(jù)分析窗口出現(xiàn)的，提供分析使用的數(shù)量遺傳模型信息，以及相關(guān)指導(dǎo)。

1.8 致謝(Acknowledgements)

2 DeltaGen的應(yīng)用舉例

以蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院育種與種子研究團(tuán)隊(duì)草木樨(Melilotus)育種數(shù)據(jù)[13]來舉例說明DeltaGen的應(yīng)用。草木樨為豆科二年生自花或異花授粉植物[14]。前期試驗(yàn)，從國外引進(jìn)19份草木樨種質(zhì)進(jìn)行農(nóng)藝學(xué)與品質(zhì)性狀的初步評(píng)價(jià)[15]，對(duì)草木樨的香豆素含量[16]和屬內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[17]進(jìn)行了研究，基于草木樨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)了SSR標(biāo)記輔助育種[18-19]。2014-2015年試驗(yàn)選擇的40份草木樨半同胞家系種質(zhì)在榆中和臨澤兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)，表現(xiàn)好的家系用于后續(xù)育種[20]。本文選擇草木樨多年多點(diǎn)評(píng)價(jià)的部分農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)作為實(shí)例說明DeltaGen的應(yīng)用，這些農(nóng)藝性狀包括干重 (dry matter yield，YLD)、株高 (plant height，PH)、莖粗(stem diameter, SD)、分枝數(shù)(stem number，SN)、春季活力(spring vitality，SR)、葉面積(leaf area，LA)。

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

打開DeltaGen網(wǎng)址，點(diǎn)擊主菜單工具欄Trial Design進(jìn)入設(shè)計(jì)頁面，設(shè)計(jì)類型選擇完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)(Randomized Completely Block)，區(qū)組數(shù)(Number of Block)為3，處理數(shù)(Number of Tre)為40，填寫合適的行(Row)：5和列(Column)：8，點(diǎn)擊Run，設(shè)計(jì)完成后點(diǎn)擊Design Check查看設(shè)計(jì)圖，拖動(dòng)設(shè)計(jì)圖下載。行列試驗(yàn)設(shè)計(jì)圖如圖2所示。

設(shè)計(jì)結(jié)果保存為csv格式的文件，為收集試驗(yàn)數(shù)據(jù)做準(zhǔn)備。

2.2 數(shù)據(jù)輸入

點(diǎn)擊主菜單工具欄Data Input，點(diǎn)擊Upload，Browse選擇文件上傳原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)在Excel中整理，上傳格式為CSV格式并對(duì)性狀重新命名(如果數(shù)據(jù)取自Examples則無需重新命名)，點(diǎn)擊Run，上傳完成。

2.3 數(shù)據(jù)檢驗(yàn)

在數(shù)據(jù)分析之前以原始數(shù)據(jù)作圖或數(shù)據(jù)透視表檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。點(diǎn)擊主菜單工具欄Graphs and Tables，點(diǎn)擊Plot，選擇直方圖(Histogram)，X變量(X-variable)選擇要檢驗(yàn)的性狀，按Ctrl鍵選擇多個(gè)性狀。本文選擇干重(YLD)、株高(PH)、莖粗(SD)、分枝數(shù)(SN)，點(diǎn)擊Density顯示數(shù)據(jù)分布曲線，生成直方圖如圖3所示，符合正態(tài)分布，不進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。

2.4 數(shù)據(jù)分析

2.4.1 混合線性模型分析

點(diǎn)擊主菜單工具欄(Models)。

圖2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)圖Figure 2 Field trial design

選擇單變量分析(Univariate)。點(diǎn)擊Modelling，依次選擇性狀作為主要處理(Primary Trait)，計(jì)算出每個(gè)性狀基于最佳線性無偏預(yù)測(BLUP)的混合線性模型的平均值，去除環(huán)境對(duì)表型的影響，使用BLUP標(biāo)準(zhǔn)化后的性狀平均值進(jìn)行后續(xù)分析；點(diǎn)擊遺傳增益和模擬(Genetic Gain and Simulation)，基于在Modelling中選擇的作為主要處理的性狀進(jìn)行遺傳增益計(jì)算和育種模擬。本例選擇干重作為主要處理性狀進(jìn)行模擬。在模擬變量(Simulation Variables)中填寫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(Industry Standard)、策略(Strategy)、選擇壓力(Selection Pressure)、田間試驗(yàn)成本(Field Trial Cost)，點(diǎn)擊update，輸出界面如圖4所示。按照20%的選擇壓力對(duì)干重進(jìn)行單一性狀選擇，在這一選擇周期遺傳增益為17.07%，在Modelling中選擇其他性狀作為主要處理性狀，重復(fù)上述步驟可計(jì)算其他性狀的遺傳增益，如表1所列。在這6個(gè)性狀之中，干重經(jīng)過一個(gè)選擇周期之后預(yù)期遺傳增益(ΔG)和相對(duì)親本的遺傳增益(%ΔG)增加百分比都最高，為17.07%和16.42%，莖粗的遺傳增益百分比增加最低，為0.16%，株高的相對(duì)親本遺傳增益增加百分比最低，為1.22%。育種成本為虛擬數(shù)值，僅用于說明DeltaGen進(jìn)行育種過程模擬計(jì)算育種成本的功能。

圖3 檢驗(yàn)原始數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布的直方圖Figure 3 A histogram used to verify that the raw data conforms to a normal distribution

選擇多變量分析(Multivariate)。點(diǎn)擊Plot，選擇性狀(可選擇多個(gè))，生成基于原始數(shù)據(jù)的表型相關(guān)Biplot或Matrix Plot圖(圖5)。40份種質(zhì)中6個(gè)性狀的表型相關(guān)性分析表明，產(chǎn)量與莖粗正相關(guān)性最大，相關(guān)性系數(shù)為0.66；產(chǎn)量與株高正相關(guān)性次之，相關(guān)性系數(shù)為0.48；春季活力與其余5個(gè)性狀均表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，與產(chǎn)量正相關(guān)性極強(qiáng)，相關(guān)性系數(shù)為0.83(春季活力從優(yōu)到劣分為1～5個(gè)等級(jí)，表型值越大活力越弱，與其他5個(gè)性狀表現(xiàn)相反)；分枝數(shù)與葉面積表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)為-0.07。

2.4.2 模式分析

點(diǎn)擊主菜單工具欄Pattern Analysis，使用標(biāo)準(zhǔn)化BLUP值進(jìn)行分析。點(diǎn)擊Cluster Analysis，進(jìn)行聚類分析和生成聚類熱圖(圖6)。聚類分析后的各分組詳情如表2所列。

使用標(biāo)準(zhǔn)化BLUP值去除環(huán)境影響，只考慮基因型的作用，基于6個(gè)性狀在40份種質(zhì)中的表現(xiàn)將40份種質(zhì)分為3類(表2)。熱圖從紅色到藍(lán)色性狀表型值依次降低，第1類種質(zhì)中株高(PH)、干重(YLD)、莖粗(SD)、分枝數(shù)(SN)、葉面積(LA)、春季活力(SR)(春季活力從優(yōu)到劣分為1～5個(gè)等級(jí)，表型值越大活力越弱，與其他5個(gè)性狀表現(xiàn)相反)均表現(xiàn)最高；第2類種質(zhì)株高、產(chǎn)量、莖粗、葉面積、春季活力表現(xiàn)居中，分枝數(shù)表現(xiàn)最低；第3類種質(zhì)分枝數(shù)表現(xiàn)居中，株高、產(chǎn)量、莖粗、葉面積、春季活力均表現(xiàn)最低(圖6)。

圖4 遺傳增益和模擬輸出界面Figure 4 Genetic gain and simulation output interface

表1 基于兩個(gè)地點(diǎn)評(píng)價(jià)的草木樨經(jīng)過一個(gè)選擇周期獲得的預(yù)期遺傳增益Table 1 Predicted genetic gain (ΔG) obtained from per selection cycle based on the Melilotus across two sites evaluation%

圖5 各性狀的表型皮爾遜相關(guān)矩陣圖(Matrix Plot)Figure 5 Pearson correlation matrix (Matrix Plot)of phenotypic traits

點(diǎn)擊PCA Biplot，進(jìn)行主成分分析。按Ctrl+A選擇所有性狀，選擇使用標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)、顯示主成分概述，點(diǎn)擊Run。生成主成分分析散點(diǎn)圖(圖7)，和PCA特征值概述(表3)。對(duì)草木樨種質(zhì)的6個(gè)表型相關(guān)性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明前2個(gè)主成分特征值大于1，入選為主成分，累積貢獻(xiàn)率77.0%。第一主成分解釋了總體性狀變異的58.3%，第二主成分解釋了總體性狀變異的18.7%(表3)。

主成分分析散點(diǎn)圖選擇特征值較大的前3個(gè)成分作為主成分解釋了總體性狀變異的87.9%。紅色代表第一主成分，包括產(chǎn)量、株高、莖粗、分枝數(shù)等與牧草產(chǎn)量相關(guān)的性狀；綠色代表第二主成分葉面積，與牧草質(zhì)量相關(guān)；藍(lán)色代表第三主成分春季活力。性狀間的相互關(guān)系由兩個(gè)性狀位置及夾角表示。數(shù)字表示40份種質(zhì)。去除環(huán)境對(duì)表型的影響之后產(chǎn)量與莖粗呈極強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系，與株高和分枝數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，分枝數(shù)與葉面積呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖7)。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)化BLUP值的40份種質(zhì)的聚類分析和6個(gè)性狀的表達(dá)熱圖Figure 6 Cluster analysis of 40 accessions with standardized BLUP values and expression heat map of 6 traits

表2 標(biāo)準(zhǔn)化BLUP值的40份種質(zhì)聚類表Table 2 40 accessions cluster tables using standardized BLUP values

圖7 主成分分析散點(diǎn)圖Figure 7 Principal component analysis scatter plot

表3 主成分特征值的分析Table 3 Analysis of principal component eigenvalues

3 討論與結(jié)論

植物育種是一個(gè)多學(xué)科交叉的過程，沒有豐富經(jīng)驗(yàn)的育種者難以理解和把握，依靠Excel和SPSS等工具處理育種數(shù)據(jù)，不能夠很好地挖掘數(shù)據(jù)中的信息。隨著信息技術(shù)的興起，人們逐漸認(rèn)識(shí)到計(jì)算機(jī)模擬為植物育種計(jì)劃提供決策支持的重要性[21]，隨之出現(xiàn)了一系列模擬育種過程，為育種者提供策略選擇幫助的工具，例如Plabsoft[22]、QUGENE[7]和Selectiongain[23]。這些軟件作為戰(zhàn)略育種工具具有很高的應(yīng)用價(jià)值。但是，由于其是基于計(jì)算機(jī)模擬，在野外育種計(jì)劃中應(yīng)用較為不穩(wěn)定，并且操作需專業(yè)技術(shù)支持、實(shí)施困難，造成這類軟件不易推廣，使用人數(shù)少。直至現(xiàn)在仍然有大多數(shù)育種者在使用Excel和SPSS處理育種數(shù)據(jù)。而簡便易學(xué)、步驟清晰的DeltaGen集試驗(yàn)設(shè)計(jì)生成、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、統(tǒng)計(jì)和數(shù)量遺傳分析、育種策略評(píng)估和指數(shù)選擇等功能于一體，可以為育種者提供綜合解決方案，縮短育種周期，減少盲目性，節(jié)省大量人力、物力和財(cái)力。

對(duì)草木樨育種數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，證明了使用DeltaGen可以成功完成關(guān)鍵分析程序。對(duì)此，駱凱等[24]使用GenStat進(jìn)行了預(yù)期遺傳增益和模式分析，結(jié)果與本研究所用DeltaGen的分析結(jié)果基本相同(表1、圖7)。

此外，DeltaGen除了作為試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和策略選擇工具，在其Help工具欄有詳細(xì)的使用步驟和理論指導(dǎo)，可以作為學(xué)習(xí)數(shù)量遺傳學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)的工具。軟件現(xiàn)已用于蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院研究生和本科生草類植物育種學(xué)教學(xué)。DeltaGen的終端還在繼續(xù)改進(jìn)，希望能為更多的植物育種者提供幫助。