黃歆，汪瑜，羅梅懿，宋永丹，楊浩森

作者單位：1成都市第七人民醫(yī)院骨科，四川 成都 610000；2四川省人民醫(yī)院骨科，四川 成都 610000

骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨脆性增加和易于發(fā)生骨折的全身性骨代謝疾?。?］。該病多見于絕經(jīng)后婦女、老年男性和多種慢性病病人，日益引起人們的重視。當(dāng)前，治療骨質(zhì)疏松的藥物主要有三類：①抑制骨吸收，如雌激素、降鈣素（CT）、雙膦酸鹽；②促骨形成，如甲狀旁腺激素（PTH）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）；③促進(jìn)骨礦化，如鈣劑［2］。雷奈酸鍶是可以促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的雙重作用新型藥物，是近年來治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松的藥物研究熱點(diǎn)［3］。為考察雷奈酸鍶抗骨質(zhì)疏松的藥物作用及機(jī)制，本研究自2017年10月至2018年2月采用肌內(nèi)注射地塞米松方式，建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，通過考察骨形態(tài)學(xué)以及血清相關(guān)骨代謝標(biāo)志物，評(píng)估雷奈酸鍶抗骨質(zhì)疏松效果，為臨床應(yīng)用雷奈酸鍶治療提供客觀的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥物雷奈酸鍶干混懸劑，每袋2 g，法國(guó)施維雅藥廠，生產(chǎn)批號(hào)H20120291；地塞米松注射液，每支2.5 mg，Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)H44024469；Rat IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒，Rat BALP ELISA檢測(cè)試劑盒，Rat TRACP 5b ELISA檢測(cè)試劑盒，Rat CTXI ELISA檢測(cè)試劑盒，Rat OCN ELISA檢測(cè)試劑盒，Rat HVD ELISA檢測(cè)試劑盒；多聚甲醛、伊紅液、蘇木素（AR級(jí)）；MEM培養(yǎng)基、南美胎牛血清，等。

1.2 主要儀器Multlskan酶標(biāo)儀（賽默飛世爾），DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)），UPH-Ⅱ-10T優(yōu)譜超純水（成都超純科技）；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（徠卡-2016，德國(guó)），TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)（中威電子），BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)（中威電子），PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（中威電子），BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪）；倒置生物顯微鏡AE31（麥克奧迪），MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋電機(jī)）；SYQ-DSX-280B壓力蒸汽滅菌器（上海宜川），BN-200高精密電子天平（臺(tái)灣巨林櫻花）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡SPF級(jí)雌性SD大鼠30只；體質(zhì)量（226±8）g；3月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠24只，體質(zhì)量（270±12）g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川2013-24），使用許可證號(hào)：SYXK（川2014-189）。動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.4 大鼠骨質(zhì)疏松模型制備及實(shí)驗(yàn)分組6～8周齡清潔級(jí)雌性SD大鼠30只，飼喂常規(guī)飼料，自由飲水，清潔級(jí)飼養(yǎng)。將大鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組（不做處理），模型組（每周2次地塞米松1 mg/kg肌肉注射），雷奈酸鍶高劑量組（每周2次地塞米松1 mg/kg肌肉注射+每天1次灌胃雷奈酸鍶800 mg/kg），雷奈酸鍶中劑量組（每周2次地塞米松1 mg/kg肌注+每天1次灌胃雷奈酸鍶600 mg/kg），雷奈酸鍶低劑量組（每周2次地塞米松1 mg/kg肌肉注射+每天1次灌胃雷奈酸鍶400 mg/kg），同室常規(guī)飼養(yǎng)5周，第5周最后1次給藥結(jié)束后2 h，采集樣本，用于指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 左脛骨組織形態(tài)學(xué)測(cè)定處死大鼠，分離左脛骨，用4%多聚甲醛固定3 d，然后10%EDTA脫鈣5周，用電鋸從矢狀面剖開，暴露骨髓腔并取左脛骨近端，制備常規(guī)脫鈣骨組織蠟塊，切4 μm厚骨組織切片，HE染色，光鏡下觀察骨形態(tài)改變，每張切片選取5個(gè)視野，取其平均值，利用MOTIC Med 6.0型圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)測(cè)量，計(jì)算骨形態(tài)指標(biāo)：平均骨小梁間距（Tb.sp），平均骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.6 血清指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1血清采集 處死大鼠前，在乙醚麻醉狀態(tài)下從背部主動(dòng)脈采集血液，血液收集后，4℃靜置3 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，分裝于小EP管中，-70℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2指標(biāo)檢測(cè) 按試劑盒說明，采用ELISA法，檢測(cè)血清白介素-6（IL-6）、血骨堿性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP 5b）、I型膠原C端肽（CTX-I）、骨鈣素（OCN）和25-羥維生素D（25-HVD）。

1.7 細(xì)胞指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1載藥血清的制備 按參考文獻(xiàn)［4］方法，制備雷奈酸鍶載藥血清。取3月齡雌性SD大鼠24只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組（n＝6）：雷奈酸鍶低、中、高劑量給藥組和空白對(duì)照組。雷奈酸鍶劑量組，按人鼠體表面積法換算，以成人臨床等效劑量的1、3、9倍劑量灌胃，對(duì)照組灌胃等體積的生理鹽水。每天1次，連續(xù)給藥7 d，末次給藥后2 h，無菌操作，心臟取血，3 000 r/min離心30 min，分離血清，56℃水浴30 min滅活。采用0.22 μm濾器除菌，-70℃保存?zhèn)溆谩Ｓ脮r(shí)以無血清DMEM稀釋為10%濃度的含藥血清。

1.7.2大鼠成骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 按參考文獻(xiàn)［4］，無菌條件下，取24 h內(nèi)新生大鼠顱蓋骨，去除骨縫及骨膜組織，用預(yù)冷的PBS清洗3次，之后用0.25%胰酶消化清除脂肪和軟組織，剪成1 mm3的小塊，0.1%膠原酶消化45 min，再用無血清DMEM沖洗，置20%小牛血清DMEM培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)。

1.7.3雷奈酸鍶對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響 消化收集成骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為每毫升4×104個(gè)，按照每孔200 μL接種于96孔板，貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，在相應(yīng)的培養(yǎng)孔內(nèi)分別加入高、中、低劑量的雷奈酸鍶的含藥血清及空白血清，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入200 μL 0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570nm處各孔的吸光值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有計(jì)量資料以xˉ+s表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較為HSD-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨組織形態(tài)學(xué)觀察HE染色結(jié)果提示，地塞米松模型組大鼠骨小梁變細(xì)、數(shù)量明顯減少，排列疏松，甚至斷裂，骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較多大的空白區(qū)域；雷奈酸鍶中、高劑量組（600，800 mg/kg）骨小梁變粗且致密，骨連續(xù)性較好，排列較為規(guī)則（圖1）。MOTIC Med 6.0型圖像系統(tǒng)分析，較模型組，雷奈酸鍶中、高劑量組的平均骨小梁厚度明顯升高（P＜0.05），骨小梁間距明顯降低（P＜0.05）。見表1。

圖1 各組大鼠骨組織（HE染色×200）：A為高劑量組；B為中劑量組；C為低劑量組；D為空白組；E為模型組

表1 雷奈酸鍶對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響/（μm，±s）

表1 雷奈酸鍶對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響/（μm，±s）

注：與模型組相比aP＜0.05，Tb.Th為平均骨小梁厚度，Tb.sp為平均骨小梁間距

組別 鼠數(shù)T b.T h T b.s p空白對(duì)照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組F值P值6 6 6 6 6 5 3.9 2±3.3 9 a 3 8.0 0±2.3 6 5 2.0 0±4.4 4 a 4 8.5 0±4.0 5 a 4 0.8 4±3.1 2 2 3.0 6 4 0.0 0 0 1 4 2.0 6±1 1.1 5 a 1 8 9.9 0±1 9.2 7 1 5 0.0 2±2 0.8 6 a 1 5 4.2 6±1 3.8 6 a 1 7 4.6 0±1 1.7 1 9.1 5 8 0.0 0 0

2.2 血清指標(biāo)檢測(cè)模型組與空白組相比，所有檢測(cè)指標(biāo)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明所選指標(biāo)，具有良好的指示作用。雷奈酸鍶高劑量組較模型組大鼠血清IL-6、BALP、TRACP 5b、CTX-I均明顯降低（P＜0.05，P＜0.05），OCN、25-HVD明顯升高（P＜0.05）。見表2。

2.3 大鼠成骨細(xì)胞增殖影響雷奈酸鍶高、中、低含藥血清組OD值和空白組比較，高、中劑量組有明顯細(xì)胞增殖作用（P＜0.05）；低劑量組細(xì)胞增殖作用不明顯（P＞0.05）。結(jié)果表明，高、中劑量雷奈酸鍶載藥血清對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用（表3）。

表2 清潔級(jí)雌性SD大鼠30只實(shí)驗(yàn)分組后各組相應(yīng)指標(biāo)變化情況/±s

表2 清潔級(jí)雌性SD大鼠30只實(shí)驗(yàn)分組后各組相應(yīng)指標(biāo)變化情況/±s

注：與模型組相比aP＜0.05，IL-6為白介素-6、TRACP 5b為抗酒石酸酸性磷酸酶5b、CTX-I為I型膠原C端肽、OCN為骨鈣素，25-HVD為25-羥維生素D

組別空白對(duì)照組模型組高劑量中劑量低劑量F值P值鼠數(shù)6 6 6 6 6 IL-6/（ng/L）20.18±3.41a 24.36±1.54 21.25±1.79a 22.85±2.57 23.16±2.79 2.582 0.062 BALP/（ng/mL）1.35±0.15a 3.48±0.51 2.31±0.21a 2.94±0.42 3.09±0.72 20.433 0.000 TRACP 5b/（U/L）2.85±0.71a 5.70±0.94 4.18±0.95a 4.51±0.78a 4.73±0.66 9.569 0.000 CTX-I/（ng/L）187.87±29.95a 357.16±36.90 279.73±43.69a 305.98±50.58 325.45±42.85 14.499 0.000 OCN/（ng/mL）6.08±0.73a 4.37±0.95 5.62±1.05a 5.00±0.40 5.18±0.99 3.407 0.024 25-HVD/（ng/mL）27.78±2.43a 20.94±2.97 24.51±1.11a 23.34±2.49 22.83±3.66 5.414 0.003

表3 雷奈酸鍶對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響/±s

表3 雷奈酸鍶對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響/±s

注：劑量組與空白對(duì)照組相比，aP＜0.05

組別 鼠數(shù)O D值空白對(duì)照組高劑量組中劑量組低劑量組F值P值6 6 6 6 0.3 8±0.0 1 0.4 5±0.0 2 a 0.4 0±0.0 2 a 0.3 9±0.0 1 2 5.2 7 0 0.0 0 0

3 討論

骨質(zhì)疏松是系統(tǒng)性骨骼性疾病，西醫(yī)認(rèn)為，其發(fā)病機(jī)制在于骨形成代謝過程中，骨吸收和骨形成發(fā)生失衡。臨床表現(xiàn)為骨小梁變細(xì)變薄，斷裂，數(shù)量減少，孔隙變大，生物力學(xué)性能降低，骨密度下降，往往伴隨骨微觀結(jié)構(gòu)退化和骨量降低，骨脆性增加，病人易發(fā)生骨折［5］。雷奈酸鍶化學(xué)名為5-［二（羧甲基）氨基］-3-羧甲基-4-氰基-2-噻吩羧酸二鍶鹽，是由穩(wěn)定態(tài)鍶原子和有機(jī)雷奈酸組成［6］，新型的抗骨質(zhì)疏松藥物。本研究以地塞米松誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松為病理模型，首先考察了不同劑量的雷奈酸鍶對(duì)模型鼠骨形態(tài)學(xué)影響。骨質(zhì)疏松癥的重要特征是骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化。骨小梁的數(shù)量、骨連續(xù)性、排列構(gòu)象以及平均骨小梁間距、平均骨小梁厚度等顯微結(jié)構(gòu)影響著骨的生物力學(xué)特性，因此骨顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)的改變可以更直接地反映骨質(zhì)疏松的情況。骨組織病理學(xué)檢測(cè)是反映骨顯微結(jié)構(gòu)變化的最直接的依據(jù)，評(píng)價(jià)骨顯微結(jié)構(gòu)的金標(biāo)準(zhǔn)［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷奈酸鍶高劑量組的骨小梁變粗且致密，骨連續(xù)性較好，排列較為規(guī)則，相比對(duì)照組，可以顯著改善骨小梁間距、平均骨小梁厚度。提示雷奈酸鍶對(duì)改善顯微結(jié)構(gòu)具有一定的療效。

本研究還考察了雷奈酸鍶對(duì)骨代謝血清標(biāo)志物以及對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響。IL-6、BALP、5b（TRACP 5b）和CTX-I是骨質(zhì)疏松的指示性血清指標(biāo)。IL-6可由造血干細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，是調(diào)節(jié)骨代謝的重要蛋白質(zhì)因子之一。IL-6不僅可直接刺激骨吸收，還能刺激骨髓的多核細(xì)胞呈現(xiàn)破骨細(xì)胞的表現(xiàn)型，加速骨吸收［8］。臨床研究也證實(shí)：骨質(zhì)疏松病人血清IL-6水平明顯高于同齡正常人［9］。BALP由成骨細(xì)胞分泌，在成骨過程中BALP水解膦酸酯，促進(jìn)基質(zhì)礦化［10］，骨質(zhì)疏松病人BALP活性增高［11］。TRACP在血液循環(huán)中，有兩種形式：TRACP5a和TRACP5b，其水平大體相等［12］。血清TRACP5a來源于巨噬細(xì)胞，是細(xì)胞活躍狀態(tài)的標(biāo)志［13］；而血清TRACP5b雖然可來源于巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞，但由激活的巨噬細(xì)胞分泌的TRACP5b無酶活性，只有破骨細(xì)胞來源的TRACP5b才具有酶活性，因此TRACP5b可作為破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收的有效標(biāo)志物［14-15］。臨床研究表明，骨質(zhì)疏松病人，血清TRACP5b活性增高［16-18］。骨纖維主要是由Ⅰ型膠原蛋白形成，CTX-I可反映破骨細(xì)胞活性及骨吸收的指標(biāo)，臨床上骨質(zhì)疏松病人CTX-I升高，其是骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物中首選的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)［19-21］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M血清IL-6、BALP、5b（TRACP 5b）和CTX-I均顯著高于正常組，從指示性血清指標(biāo)的角度印證了骨質(zhì)疏松造模成功，雷奈酸鍶高劑量組可顯著降低上述血清指標(biāo)，對(duì)抗骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的指示性血清指標(biāo)的上升。OCN是由成骨細(xì)胞合成分泌的一種特異性非膠原蛋白，當(dāng)骨形成和骨吸收去耦合時(shí)是骨形成的特異性標(biāo)志物［22］；25-HVD雖然不能直接反映出成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，但是由于其能調(diào)節(jié)鈣、磷的代謝，因此其對(duì)骨代謝也有重要影響［23］。臨床上骨質(zhì)疏松病人的血清OCN和25-HVD均降低［24-25］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量的雷奈酸鍶可顯著的改善血清OCN和25-HVD，對(duì)抗骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的其血清水平降低。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞因具有與體內(nèi)成骨細(xì)胞相同的生物特性，體外培養(yǎng)成為研究骨代謝和成骨機(jī)制的重要手段。本研究實(shí)驗(yàn)表明，雷奈酸鍶可促進(jìn)體外成骨細(xì)胞增殖。

雷奈酸鍶可改善骨微細(xì)結(jié)構(gòu)和骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低血清IL-6、BALP、5b（TRACP 5b）、CTX-I，提升血清骨鈣素、25-羥維生素D，同時(shí)能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成，發(fā)揮對(duì)骨的保護(hù)作用，具有治療骨質(zhì)疏松的作用。（本文圖1見插圖9-2）