王景媛，史亞軍，黃維，王春龍

作者單位：陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046

冠心病主要是由冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化引起管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟?。?］。復(fù)方龍脈寧方是陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科陶根魚(yú)教授的經(jīng)驗(yàn)方，處方由葛根、川芎、穿山龍、蜂膠四味中藥組成，功能通絡(luò)活血，消炎化瘀，臨床應(yīng)用于冠心病的治療。雖然復(fù)方龍脈寧提取物的活性成分有確切的藥理效應(yīng)，但由于其水溶性、脂溶性均較差的特點(diǎn)造成了口服吸收較為困難，且藥物在體內(nèi)的生物利用度不高，從而極大地限制了藥物的臨床使用［2］。相關(guān)研究證明，磷脂復(fù)合物作為一種新型給藥系統(tǒng)，用于中藥有效部位的改性時(shí)可有效提高有效部位的脂溶性和水溶性［3］。本研究自2017年12月至2018年4月將復(fù)方龍脈寧提取物的制備工藝與磷脂復(fù)合物技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)評(píng)價(jià)改性前后提取物和磷脂復(fù)合物在十二指腸段的吸收情況，以論證此工藝能改善復(fù)方龍脈寧的生物藥劑學(xué)特性［4］，對(duì)復(fù)方龍脈寧的生物利用度的提高做出理論支持。

1 材料

梅特勒-托利多AR114電子天平；78-1型磁力攪拌器；Thermo Scientific Heraeus Labofuge400R臺(tái)式離心機(jī)；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵。Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀。

SD大鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［合格證號(hào)：SYXK（陜）2017-014）］；葛根（批號(hào)20171226）、穿山龍（批號(hào)20171011）、川芎（批號(hào)20170907）均購(gòu)自寶雞向源中藥飲片有限責(zé)任公司；蜂膠（陜西省咸陽(yáng)市自然之子蜂產(chǎn)品公司，批號(hào)20170821）。葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110773-201612，純度≥98%）；大豆卵磷脂（上海太偉藥業(yè)，批號(hào)040801，PC≥82%）；復(fù)方龍脈寧提取物、復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物、Krebs-Ringers腸營(yíng)養(yǎng)液為均為自制；乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)Fisher）；水為蒸餾水；其他試劑均為分析純（天津科密歐試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物制備工藝

2.1.1復(fù)方龍脈寧提取物制備工藝［5］按原方比例取葛根，穿山龍，川芎三味藥材，用8倍量70%濃度的乙醇回流提取3次，每次2 h，提取完成后回收乙醇，提取液減壓濃縮至適量，采用大孔吸附樹(shù)脂法對(duì)提取液進(jìn)行純化，樹(shù)脂型號(hào)為AB-8，提取液與樹(shù)脂比例為1 mL∶1 g，洗脫液為80%濃度乙醇，洗脫速度為0.5 BV/h，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮至適量后，按原方比例加入除蠟后的蜂膠，混勻，噴霧干燥，即得。

2.1.2磷脂復(fù)合物制備及評(píng)價(jià)［6］將“2.1.1”項(xiàng)下制得的復(fù)方龍脈寧提取物和一定量的磷脂置于圓底燒瓶中，加入一定量無(wú)水乙醇，將圓底燒瓶置于磁力攪拌器上進(jìn)行恒溫?cái)嚢瑁磻?yīng)一段時(shí)間后，減壓回收無(wú)水乙醇，將圓底燒瓶?jī)?nèi)壁上的產(chǎn)物刮取下來(lái)，置于減壓干燥箱中干燥，得到復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物。

2.1.3復(fù)合率測(cè)定方法的建立［7］分別稱取已經(jīng)研磨成細(xì)分的復(fù)方龍脈寧提取物1 g于50 mL三角瓶中，分別加入表1中的試劑20 mL，置于室溫（25℃）下，每5 min強(qiáng)力震蕩30 s，持續(xù)30 min，濾過(guò)，濾液用恒重后的蒸發(fā)皿收集，置于80℃水浴鍋上烘干后，轉(zhuǎn)移至烘箱烘干至恒重，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

溶解率＝（W1-W2）/W3×100%，W1＝蒸發(fā)皿+溶解物質(zhì)量，W2＝蒸發(fā)皿質(zhì)量，W3＝龍脈寧提取物質(zhì)量。

從表1可得，復(fù)方龍脈寧提取物在甲苯中的溶解性較低，為0.7%，因此選擇甲苯作為測(cè)定復(fù)合率的溶劑。

利用龍脈寧提取物難溶于甲苯，而大豆卵磷脂和龍脈寧提取物磷脂復(fù)合物易溶于甲苯的特點(diǎn)［8］，將定量的龍脈寧提取物和大豆卵磷脂復(fù)合后，減壓除去反應(yīng)溶劑，取出，研磨成細(xì)粉，精密稱定1 g龍脈寧提取物磷脂復(fù)合物，將復(fù)合物置于錐形瓶中，充分溶解其中的磷脂及磷脂復(fù)合物，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取出，將上清液轉(zhuǎn)移至己恒重的蒸發(fā)皿中，除去甲苯，稱定其重量。復(fù)方龍脈寧提取物與大豆卵磷脂復(fù)合率（%）＝［M2-（M1-M2）×λ］/M1×100%（M1＝磷脂復(fù)合物質(zhì)量，M2＝磷脂復(fù)合物溶于甲苯的質(zhì)量，λ＝磷脂與藥物質(zhì)量比）。依照此法檢驗(yàn)三批樣品，計(jì)算各樣品復(fù)合率的平均值，從而計(jì)算出復(fù)方龍脈寧與大豆卵磷脂的復(fù)合率。

表1 復(fù)方龍脈寧提取物在不同溶劑中的溶解度

2.1.4單因素實(shí)驗(yàn) 復(fù)合率的影響因素包括復(fù)合溶劑的類型、復(fù)合的時(shí)間與溫度、藥脂比以及藥物的濃度，由于提取物與磷脂的復(fù)合實(shí)質(zhì)上是分子間的結(jié)合［9］，這就要求復(fù)方龍脈寧提取物在進(jìn)行復(fù)合的溶劑中溶解度較高，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終復(fù)合溶劑為無(wú)水乙醇，且復(fù)合率的影響因素為復(fù)合時(shí)間、藥物濃度以及藥脂比等，而復(fù)合溫度對(duì)復(fù)合效果的影響為低濃度時(shí)提取物與磷脂的復(fù)合率受反應(yīng)溫度的影響較小，而高濃度時(shí)提取物與磷脂的復(fù)合率則受反應(yīng)溫度影響較大，具體表現(xiàn)為溫度在40℃以上時(shí)復(fù)合率隨著溫度的增高而降低。

2.1.5正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的考察結(jié)果，選擇最佳反應(yīng)溶劑為乙醇、反應(yīng)溫度為40℃、高藥物濃度時(shí)，以藥物濃度（A）、藥脂比（B）和復(fù)合時(shí)間（C）做三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用L9（33）表，因素水平表見(jiàn)表2，結(jié)果見(jiàn)表3，4。

表2 因素水平表

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表

由直觀分析可知，最佳工藝參數(shù)為A1B2C3，即藥物濃度為80 mg/mL，藥脂比為1∶3，反應(yīng)時(shí)間為12 h，方差分析結(jié)果顯示藥脂比以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)結(jié)果無(wú)顯著性影響。按此優(yōu)化條件制得3批復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物，測(cè)得磷脂復(fù)合物的平均復(fù)合率為86.72%。

2.2 復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物十二指腸吸收研究以葛根素為指標(biāo)，使用HPLC進(jìn)行測(cè)定，采用外翻腸囊法研究復(fù)方龍脈寧提取物改性前后在十二指腸的吸收變化，以評(píng)價(jià)復(fù)方龍脈寧提取物改性前后的改善情況。

2.2.1色譜條件 色譜柱為Hypersil ODSC18（250mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（25∶75），檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，流速為1mL/min，理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2.2.2供試品溶液的配制 取葛根素對(duì)照品，用“2.2.1”項(xiàng)下流動(dòng)相稀釋成濃度為0.051 2 mg/mL的葛根素溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取過(guò)量復(fù)方龍脈寧提取物及磷脂復(fù)合物于錐形瓶中，加入Krebs-Ringers腸營(yíng)養(yǎng)液，充分?jǐn)嚢瑁盟幬镲柡鸵?，? 000 r/min的速率離心10 min，取上清液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定溶液中葛根素的含量，分別配置含量為0.1，0.5，1.0mg/mL的溶液作為供試品溶液。

2.2.3十二指腸吸收實(shí)驗(yàn) 取受試SD大鼠禁食24 h，期間自由飲水，試驗(yàn)時(shí)取10%水合氯醛將大鼠腹腔注射麻醉后，取出10 cm左右十二指腸，分離出腸系膜，用37℃Krebs-Ringers腸營(yíng)養(yǎng)液將腸系膜沖洗干凈，翻轉(zhuǎn)十二指腸，結(jié)扎一端，固定另一端，加入Krebs-Ringers腸營(yíng)養(yǎng)液飽和平衡5 min，將其放入“2.2.2”項(xiàng)下保持37℃恒溫的供試液中，保持氧及二氧化碳的供入，分別在0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3 h吸取0.2 mL腸囊內(nèi)溶液，同時(shí)向腸囊內(nèi)補(bǔ)充0.2mL Krebs-Ringers腸營(yíng)養(yǎng)液，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)樣品中的葛根素含量。

2.2.4含量測(cè)定及數(shù)據(jù)處理 將各樣品置于離心機(jī)中，以3 000 r/min離心5 min，取上清液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定上清液中葛根素的含量，計(jì)算各樣品累計(jì)滲透量Q，以各樣品的Q測(cè)定值對(duì)時(shí)間進(jìn)行零級(jí)、一級(jí)、Higuchi方程擬合，通過(guò)相關(guān)系數(shù)的計(jì)算確定數(shù)據(jù)處理模型。

上式中Q：?jiǎn)挝幻娣e的累積滲透量；V0：接收液體積（mL）；Cn：第n次取樣的藥物濃度；Vi：每次的取樣體積（mL）；Ci：第n-1次測(cè)得的藥物濃度）；A：離體十二指腸腸管吸收面積。

方法學(xué)試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液4、8、10、12、16、20 μL進(jìn)樣，以峰面積A對(duì)進(jìn)樣量C（μg）進(jìn)行回歸，得到回歸方程為A＝107x+106，R2＝0.999，結(jié)果表明，葛根素在0.2～1.02μg處線性關(guān)系良好。專屬性試驗(yàn)顯示，葛根素峰分離良好，在空白樣品處沒(méi)有吸收，專屬性良好。精密度試驗(yàn)顯示，連續(xù)進(jìn)樣5次，葛根素峰面積RSD為0.96%；分別于0、2、8、12、24 h進(jìn)樣，葛根素峰面積RSD為2.15%，儀器精密度良好，樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。對(duì)照品與供試品HPLC圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖：A為葛根素對(duì)照品，B為復(fù)方龍脈寧提取物供試品

2.2.5樣品測(cè)定結(jié)果 對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)兩種樣品的含量進(jìn)行測(cè)定，將各樣品的累計(jì)滲透量對(duì)時(shí)間分別按照零級(jí)、一級(jí)、Higuchi進(jìn)行擬合，結(jié)果表明以零級(jí)擬合最佳，這表明復(fù)方龍脈寧中的葛根素在十二指腸中表現(xiàn)出了被動(dòng)擴(kuò)散的吸收特征，不同濃度樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，將三個(gè)濃度條件下的累積吸收量對(duì)時(shí)間作圖，見(jiàn)圖2～4。

表5 不同濃度樣品測(cè)定結(jié)果（n＝5）

圖2 低濃度樣品吸收曲線（±s，n＝5）

圖3 中濃度樣品吸收曲線（±s，n＝5）

圖4 高濃度樣品吸收曲線（±s，n＝5）

結(jié)果表明，提取物的腸吸收累積量與樣品濃度呈現(xiàn)的正相關(guān)，吸收速度常數(shù)呈線性遞增，這表明復(fù)方龍脈寧中的葛根素為被動(dòng)擴(kuò)散吸收。復(fù)方龍脈寧提取物經(jīng)與磷脂復(fù)合后，葛根素的腸吸收量明顯增加，高、中、低三個(gè)濃度提升量分別為65%、60%和26%。結(jié)果表明，將磷脂復(fù)合物技與復(fù)方龍脈寧提取物相結(jié)合，可明顯改善復(fù)方龍脈寧中葛根素的十二指腸吸收，這對(duì)提高復(fù)方龍脈寧的生物利用度提供了理論依據(jù)。

3 討論

復(fù)方龍脈寧方主治心腦血管疾病，在臨床應(yīng)用廣泛，療效確切，本課題在前期研究中選擇了滴丸作為劑型，取得了一定的研究進(jìn)展，但仍存在生物利用度低、用藥量大、用藥次數(shù)多等弊端。經(jīng)過(guò)方中各味藥有效成分分析，發(fā)現(xiàn)含有大量的黃酮類及其他含羥基成分，文獻(xiàn)研究表明，這些物質(zhì)與磷脂結(jié)合可改善其理化性質(zhì)及生物利用度［10］，為了改善原方中的有效成分不利于吸收的缺點(diǎn)，本研究結(jié)合磷脂復(fù)合物技術(shù)［11］，對(duì)復(fù)方龍脈寧提取物進(jìn)行處理，使其與磷脂復(fù)合，復(fù)合率較高，改善了藥物在體內(nèi)的吸收，提高了藥物在體內(nèi)的生物利用度。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，葛根素單體的磷脂復(fù)合物復(fù)合率可達(dá)100%［2］，但考慮到中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性，以及提取物中含有其他不含羥基的化合物無(wú)法與大豆卵磷脂進(jìn)行復(fù)合，86.72%的復(fù)合率已經(jīng)是一個(gè)較為理想的結(jié)果。本試驗(yàn)的復(fù)合溶劑為無(wú)水乙醇，并且對(duì)復(fù)合效果具有一定影響的復(fù)合時(shí)間、藥物濃度以及藥脂比等因素進(jìn)行了考察，從而確定了復(fù)合工藝為藥物濃度為80 mg/mL，藥脂比為1∶3，反應(yīng)時(shí)間為12h。

離體十二指腸吸收研究結(jié)果表明，磷脂復(fù)合物中葛根素的腸吸收情況相較原提取物顯著提高，吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散。但是，提取物與大豆卵磷脂復(fù)合后吸濕性增強(qiáng)，且給藥劑量、劑型選擇及藥物規(guī)格相應(yīng)改變，后續(xù)將對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行研究。