張博，劉陽，樊海鑫，陳玉，趙小梨，張麗娟，陸紅玲

作者單位：遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000

ATP熒光法快速檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)是一種以生物發(fā)光反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)菌落總數(shù)便捷、快速、準(zhǔn)確，通過該方法能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)操作流程和生產(chǎn)環(huán)境中微生物含量，可以從源頭避免因細(xì)菌總數(shù)超標(biāo)導(dǎo)致的嚴(yán)重后果，因此近些年在多個(gè)相關(guān)的行業(yè)領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是對(duì)衛(wèi)生環(huán)境要求嚴(yán)格的部門，如醫(yī)院和食品企業(yè)等等。

目前我國大多數(shù)醫(yī)院普遍都是采用消毒液來進(jìn)行殺菌消毒的，此法成本低，使用范圍廣，目前消毒的效果還是根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)（GB15982-2012）來進(jìn)行菌落總數(shù)的培養(yǎng)，此法培養(yǎng)時(shí)間長，一般需要48～72 h，但是經(jīng)過長時(shí)間的菌落培養(yǎng)等待，被消毒的位置可能菌落總數(shù)早已經(jīng)超標(biāo)，此時(shí)使用ATP熒光法就是對(duì)消毒效果是否理想很好的補(bǔ)充檢查。但是外界因素很容易影響熒光法的穩(wěn)定性，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確，這種結(jié)果的不穩(wěn)定使該方法的應(yīng)用范圍受到了很大的限制［1-6］。

本研究自2018年3—11月在ATP熒光反應(yīng)試劑中加入不同保護(hù)成分來增強(qiáng)試劑穩(wěn)定性，以次氯酸鈉（化學(xué)分子式為NaClO）消毒物表做為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，篩選一種可以明顯降低干擾次氯酸鈉消毒液檢測(cè)結(jié)果的試劑，目的是提高ATP熒光法檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，提高其在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器本研究中所用的磷酸二氫鈉，次氯酸鈉等生化試劑均為國產(chǎn)分析純，購自廣東華大技術(shù)有限公司；蛋白純化系統(tǒng)為美國GE公司生產(chǎn)的液相色譜系統(tǒng)AKTA PURIFIER；檢測(cè)熒光信號(hào)儀器為北京濱松光子技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BHP9505微量光度儀。

1.2試劑制備

1.2.1PBS緩沖液的配制 pH7.8的0.2 mol/L NaH2PO48.5 mL與0.2 mol/L Na2HPO491.5 mL混合。

1.2.2ATP熒光反應(yīng)試劑的制備 熒光素酶0.02mg/mL；D-熒光素0.003 mg/mL；pH7.8的Tris-HCl 50 mmol/L；KCl100 mmol/L；MgCl22 mmol/L；丙三醇（glyercol）10%；聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）1%。溶液配制后用一次性滅菌的0.2–m水系濾膜過濾除菌。

1.2.3消毒試劑的配制 將次氯酸鈉配制成5%的母液備用，使用時(shí)將母液現(xiàn)用滅菌蒸餾水1∶100進(jìn)行稀釋。

1.3反應(yīng)機(jī)制基于螢火蟲生物發(fā)光的原理，在有鎂離子存在的條件下，螢火蟲熒光素酶以D-熒光素、ATP、O2為底物，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能并釋放光量子［4］，其發(fā)光強(qiáng)度（I）與ATP濃度（cATP）符合函數(shù)關(guān)系；I＝Imax×cATP/Km+cATP，式中，Imax為最大發(fā)光強(qiáng)度；Km為l×l0-4?？芍?，當(dāng)cATP遠(yuǎn)小于Km時(shí)，I正比于樣品中的cATP。因此可通過測(cè)定發(fā)光體系的I值來定量ATP濃度［7］。正常條件下細(xì)菌體內(nèi)的ATP含量趨近恒定，為10-18mol［8］。以光電倍增管為核心采光部件的光度計(jì)都能檢測(cè)低于10 pg分子的ATP，這就使快速、準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)菌成為可能［9］。

1.4蛋白純化螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒由美國Cellex公司CEO James惠贈(zèng)，該質(zhì)粒載體為pET15b-sumo。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21DE3感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過培養(yǎng)挑取單克隆接菌到LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h后18℃異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)，得到的粗純蛋白質(zhì)經(jīng)過Ni+離子交換純化后，獲得較高純度的螢火蟲熒光素酶。

1.5ATP熒光試劑的成分優(yōu)化ATP熒光法在實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用的過程中非常容易受到外界因素的干擾，比如次氯酸鈉會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的最低靈敏度和穩(wěn)定性，而次氯酸鈉溶液也經(jīng)常被用在物體表面消毒的過程中。為此我們首先對(duì)熒光試劑的成分進(jìn)行優(yōu)化，在原試劑成分中加入終濃度2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和2%硫酸銨來增加熒光反應(yīng)試劑中的蛋白質(zhì)濃度和提高試劑的穩(wěn)定性。

1.6次氯酸鈉消毒后菌落總數(shù)的檢測(cè)方法選取一塊1.2 m×2 m的大理石平臺(tái)，用0.05%NaClO溶液將無菌衛(wèi)生棉浸濕，擦拭平臺(tái)表面，20 min晾干。在72 h內(nèi)分別9次采用平皿法和優(yōu)化前后兩種ATP熒光試劑同時(shí)檢測(cè)所得到樣品中的細(xì)菌總數(shù)。

1.7采樣方法將無菌棉簽用滅菌的PBS緩沖液浸濕，將棉簽在所要檢測(cè)的物體表面均勻涂擦，進(jìn)行細(xì)菌采集，采樣面積為10 cm×10 cm，將取樣后的棉簽頭部剪掉手接觸部分再次放入裝有1mLPBS滅菌的EP管中渦旋搖晃洗滌數(shù)次，即得到物體表面菌樣。將得到的菌樣進(jìn)行菌落總數(shù)（CFU）和相對(duì)發(fā)光值（RLU）檢測(cè)，以CFU和RLU值做結(jié)果分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0進(jìn)行分析，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1次氯酸鈉消毒后熒光法檢測(cè)與菌落總數(shù)相關(guān)性經(jīng)消毒劑擦拭晾干后，平皿法檢測(cè)的結(jié)果是沒有任何細(xì)菌，但采用優(yōu)化前ATP熒光試劑檢測(cè)結(jié)果卻顯示出一定的光值，在隨后的72 h，平皿法檢測(cè)結(jié)果隨著時(shí)間的增加，細(xì)菌總數(shù)隨之增加，但熒光法檢測(cè)在24 h內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果沒有規(guī)律，24 h后隨著時(shí)間的變化，熒光值（RLU）與細(xì)菌總數(shù)（CFU）有一定的相關(guān)性（圖1，2）。因此，當(dāng)被檢樣品細(xì)菌數(shù)較少時(shí)，檢測(cè)結(jié)果受次氯酸鈉的影響較大，但隨著次氯酸鈉的不斷降解和細(xì)菌總數(shù)的增加，次氯酸鈉對(duì)熒光法檢測(cè)結(jié)果的影響逐漸變小。優(yōu)化后的熒光試劑檢測(cè)的結(jié)果則與平皿法檢測(cè)的結(jié)果有一定的相關(guān)性（圖3）。

圖1 次氯酸鈉消毒后的物表72 h菌落總數(shù)變化曲線

圖2 次氯酸鈉消毒后的物表72 h熒光值變化曲線

圖3 優(yōu)化后的熒光試劑檢測(cè)次氯酸鈉消毒后的物表72 h熒光值曲線

2.2次氯酸鈉消毒后熒光法菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立我們?cè)俅瓮ㄟ^對(duì)醫(yī)院50張辦公桌和50位工作人員的手共100個(gè)樣品采用次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒，經(jīng)過5 h后，采用國標(biāo)平皿法和ATP熒光法兩種方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，將平皿法檢測(cè)菌落總數(shù)（CFU）和熒光法檢測(cè)熒光值（RLU）的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），得出公式（1）：y＝0.062 7x+12.453（R2＝0.962 5），說明在次氯酸鈉消毒后的的物體表面經(jīng)過一段時(shí)間后其菌落生物發(fā)光值與菌落總數(shù)存在著線性相關(guān)關(guān)系。

圖4 ATP熒光法檢測(cè)次氯酸鈉消毒后表面的菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3次氯酸鈉消毒后熒光法與菌落總數(shù)的檢測(cè)我們?cè)俅斡孟嗤姆椒ㄟx取醫(yī)院30處不同潔凈程度的物體表面（用次氯酸鈉溶液消毒）。把熒光法檢測(cè)得到的RLU值帶入公式（1），推算出CFU值（菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值），再將平皿法測(cè)得的CFU值（菌落總數(shù)實(shí)際值）和菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值（表1），用SPSS軟件進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析，結(jié)果表明當(dāng)經(jīng)過次氯酸鈉溶液擦拭過的物表再次采用熒光法檢測(cè)時(shí)，平皿法檢測(cè)出的實(shí)際CFU值與熒光法推測(cè)的CFU預(yù)測(cè)值在P＜0.01水平上呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝0.985。即優(yōu)化后的ATP熒光試劑在檢測(cè)次氯酸鈉溶液擦拭后的物體表面的結(jié)果與國標(biāo)平皿計(jì)數(shù)法基本一致，可以用此方法對(duì)次氯酸鈉消毒后的物體表面清潔度進(jìn)行半定量的判斷。

表1 30處不同潔凈程度的物體表面次氯酸鈉消毒后的菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值與實(shí)際推算值

醫(yī)院消毒標(biāo)準(zhǔn)-國標(biāo)（GB15982-2012）規(guī)定1 cm2的面積CFU≤5.0，本實(shí)驗(yàn)的采樣面積為10 cm×10 cm，所以檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為500 CFU，我們根據(jù)熒光法推導(dǎo)出的CFU結(jié)果與平皿法檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，并參考國標(biāo)（GB15982-2012），發(fā)現(xiàn)當(dāng)RLU值低于7 000時(shí)，無論熒光法計(jì)算出的菌落總數(shù)CFU和平皿法實(shí)測(cè)的菌落總數(shù)CFU結(jié)果均小于450，當(dāng)RLU高于8 000時(shí)，對(duì)應(yīng)CFU的結(jié)果均高于550，所以我們將光值RLU低于7 000設(shè)定為清潔；RLU高于8 000設(shè)定為污染；RLU光值7 000～8 000設(shè)定為警告，需要進(jìn)一步檢測(cè)（表2）。

表2 醫(yī)院消毒半定量標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)表2的判斷標(biāo)準(zhǔn)，我們隨機(jī)在醫(yī)院檢測(cè)了次氯酸鈉消毒后的護(hù)理托盤、醫(yī)護(hù)人員的雙手、辦公桌面。由兩個(gè)人分別各自采用一種方法進(jìn)行雙盲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示當(dāng)平皿法檢測(cè)結(jié)果細(xì)菌超標(biāo)時(shí)，熒光法測(cè)得的RLU值按照表2中設(shè)定的結(jié)果同樣為超標(biāo)。當(dāng)平皿法檢測(cè)的結(jié)果為合格時(shí)，熒光法測(cè)得的光值同樣低于設(shè)定污染的光值。驗(yàn)證試驗(yàn)共檢測(cè)15個(gè)樣品，其中平皿法測(cè)得12個(gè)為合格樣品，不合格樣品3個(gè)。熒光法測(cè)得11個(gè)為合格樣品，3個(gè)為不合格樣品，1個(gè)為警告（表3）。該結(jié)果表明該方法改進(jìn)后可以對(duì)經(jīng)過次氯酸鈉消毒液擦拭后的物體表面細(xì)菌總數(shù)的多少作出半定量的判斷。

表3 兩種方法15組盲測(cè)結(jié)果對(duì)比

3 討論

目前國標(biāo)法細(xì)菌總數(shù)測(cè)定采用的是平皿法，工作量大，等待時(shí)間長，所以大大降低了工作效率，而且對(duì)于營養(yǎng)富集的檢測(cè)樣品不能做到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，過長的檢測(cè)時(shí)間會(huì)造成細(xì)菌的大量增長，如果通過熒光法對(duì)樣品進(jìn)行半定量的測(cè)定，快速的給出樣品合格、警告、不合格的參考，則可以快速提高工作效率和避免因檢測(cè)結(jié)果時(shí)間過長造成細(xì)菌超標(biāo)的危害［8，10］。

ATP熒光法的酶促反應(yīng)對(duì)外界干擾較為敏感，而目前市場(chǎng)中常用的消毒液種類繁多，每一種消毒液對(duì)反應(yīng)的光值均有不同程度的影響，所以限制了該方法在醫(yī)院中的應(yīng)用。我們通過調(diào)研多家三甲醫(yī)院，發(fā)現(xiàn)所使用的消毒液主要成分為次氯酸鈉，所以我們將其作為首選并對(duì)檢測(cè)試劑進(jìn)行了優(yōu)化，克服了在低靈敏度時(shí)次氯酸鈉消毒液對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，并初步建立了檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。不同的醫(yī)院或部門可以根據(jù)環(huán)境衛(wèi)生的要求單獨(dú)對(duì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)化，如清潔、基本清潔、警告、污染、重度污染等。另該方法的檢測(cè)結(jié)果RLU光值能直接由儀器讀出，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不同等級(jí)的劃分，直接為使用部門提供半定量的檢測(cè)結(jié)果，避免了檢測(cè)前需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線等一系列復(fù)雜的換算過程，既為日常的檢測(cè)節(jié)約了時(shí)間，又便于檢測(cè)人員的使用。本實(shí)驗(yàn)選取了較為常見的次氯酸鈉消毒樣品來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為熒光試劑在醫(yī)院領(lǐng)域大范圍的應(yīng)用提供參考，但該試劑優(yōu)化后仍然對(duì)市場(chǎng)上其他大部分消毒液種類不具備普遍性，因此我們也在不斷的進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，力爭早日研發(fā)出更為穩(wěn)定、適應(yīng)性更廣泛的熒光快速檢測(cè)試劑。