許倩倩，包貝華，張 麗**，趙學(xué)龍，談瑄忠，李 文南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 003；南京市中醫(yī)院，南京 000

烏蘞莓 Cayratia japonica（Thunb.） Gagnep 為雙子葉葡萄科植物，藥用部位為烏蘞莓的全草或根，主要功效為清熱利濕、解毒消腫[1]。研究報(bào)道，烏蘞莓對(duì)肛周膿腫、急性扭挫傷、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病癥具有較好的臨床治療效果[2，3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗癌、抗菌、抗凝、增強(qiáng)免疫功能、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛[3，4]等作用。烏蘞莓中主要含有黃酮類的成分，如木犀草素、芹菜素、槲皮素等[5]。研究表明，木犀草素具有抗炎[6]、抗癌[7]、抗氧化[8]、抗菌[9]等藥理作用，與烏蘞莓的臨床作用相契合。

烏蘞莓軟膏為烏蘞莓單味藥方，其臨床藥效明確，現(xiàn)有的軟膏制備工藝為飲片機(jī)械取粉，加入基質(zhì)制備而得。此法藥物利用度低，為提高利用率對(duì)烏蘞莓原料進(jìn)行醇提工藝研究，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用 Box-Behnken Design（BBD）響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)[10]，以醇提干浸膏得率和木犀草素含量為指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法，優(yōu)選烏蘞莓軟膏原料的最佳醇提工藝，為其優(yōu)化制備與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AB高效液相色譜儀 （日本島津公司）；電子天平（Mettler Toledo）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9023A）；減壓干燥箱（XMTD-8222）上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超聲清洗器 （KH-500B，功率500W，頻率40Hz，昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水制備系統(tǒng)。

1.2 藥品與試劑

烏蘞莓飲片購(gòu)自安徽亳州（20170214），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定確認(rèn)；木犀草素對(duì)照品（純度99.6%，批號(hào)111520-201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；超純水。

2 方 法

2.1 樣品提取

取烏蘞莓飲片以粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩，得最粗粉。取一定量的粉末，置于具塞錐形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，加熱回流提取2次，過(guò)濾，合并濾液并定容。取提取液20mL，干燥，恒重，計(jì)算干浸膏得率。

2.2 色譜條件[11]

色譜柱：Agilent 5 HC-C18（2）（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%甲酸水（60∶40）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；柱溫：30℃；流速：0.8mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取木犀草素對(duì)照品適量，置于100mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成0.009 7mg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 乙醇濃度 稱取烏蘞莓飲片粉末5 g，置于具塞錐形瓶中，加8倍量乙醇，提取1 h、共2次，在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%條件下進(jìn)行考察。計(jì)算干浸膏得率，HPLC法測(cè)定木犀草素的提取含量，平行2份。下同。

2.4.2 醇倍量 稱取烏蘞莓飲片粉末5 g，置于具塞錐形瓶中，加70%乙醇8倍量，提取1 h，共2次，分別在加醇量為 6、8、10、12、14倍條件下進(jìn)行考察。

2.4.3 提取時(shí)間 稱取烏蘞莓飲片粉末5 g，置于具塞錐形瓶中，加8倍量70%乙醇，提取2次，分別在提取時(shí)間為1、2、3h條件下進(jìn)行考察。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、醇倍量和提取時(shí)間三個(gè)因素，采用Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)這三個(gè)因素分別在3個(gè)水平上對(duì)其提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以干浸膏得率和木犀草素含量為指標(biāo)，并根據(jù)以下方法計(jì)算兩個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)分值[12]：2個(gè)指標(biāo)分別以最高值為1，其余各組以其與最高值比值為得分，綜合得分：Z=X×0.5+Y×0.5（X 為各組干浸膏得率的得分，Y為各組木犀草素含量的得分）。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1.1 乙醇濃度對(duì)干浸膏得率和木犀草素含量的影響 由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，木犀草素含量逐漸增加，而干浸膏得率在乙醇濃度為70%時(shí)達(dá)到最高值。綜合考慮確定BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)乙醇濃度的水平為60%、70%、80%。

圖1 乙醇濃度對(duì)干浸膏得率、木犀草素含量的影響

3.1.2 醇倍量對(duì)干浸膏得率和木犀草素含量的影響 由圖2可知，在醇倍量逐漸增加，其干浸膏得率也逐漸增加；當(dāng)醇倍量為10～12倍時(shí)，木犀草素含量達(dá)到高值。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果并從大生產(chǎn)工藝考慮，確定BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的醇倍量水平為8、10、12倍。

圖2 醇倍量對(duì)干浸膏得率、木犀草素含量的影響

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)干浸膏得率和木犀草素含量的影響 由圖3可知，隨著提取時(shí)間增加，干浸膏得率及木犀草素含量均逐漸增加，故確定BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提取時(shí)間的水平為 1、2、3 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)干浸膏得率、木犀草素含量的影響

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化烏蘞莓醇提工藝

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)出三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)分別構(gòu)成三維頂點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)[13]，因素、水平及編碼值見表1；Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素和水平

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

3.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 采用Design Expert.V8.0.6軟件，以醇倍量A、提取時(shí)間B、乙醇濃度C為自變量，以雙指標(biāo)綜合評(píng)分Y為響應(yīng)值，對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到方差分析表3，對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，建立一個(gè)回歸方程：Y=+0.97+0.062A+0.015B-2.500E-003C+0.020AB+5.000E-003AC+0.030BC-0.035A2-0.040B2-0.066C2。方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

由表3方差分析結(jié)果看出，該響應(yīng)面回歸模型的 F 值為 21.34（P=0.000 3，P＜0.01），表明模型顯著，具有良好的擬合性。A、B、C三個(gè)因素的影響大小依次為 A＞B＞C，因素 A、A2、B2、C2及 BC 的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，說(shuō)明各因素與響應(yīng)值之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。該模型失擬項(xiàng)F值為1.79（P=0.289 0，P＞0.05），相關(guān)系數(shù) R2=0.964 8，表明建立的二次模型成立，該模型在本實(shí)驗(yàn)研究范圍內(nèi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.3 各因素及其交互作用對(duì)干浸膏得率和木犀草素含量的影響 利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行擬合，直觀了解各因素之間兩兩交互作用對(duì)烏蘞莓醇提工藝的影響。由圖4可知，提取時(shí)間、醇倍量、乙醇濃度3個(gè)因素的結(jié)果均呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中醇倍量的降幅較小，僅略有降低。圖4中顯示了兩兩交互作用的影響結(jié)果，左邊均為等高線圖，不同因素之間的交互關(guān)系均為橢圓形，說(shuō)明兩兩交互作用均較為顯著；右邊為三維曲面圖，均為山峰形，且曲面坡度均較為陡峭，同樣說(shuō)明交互作用較為顯著，尤其B、C交互作用、即提取時(shí)間與乙醇濃度交互作用的曲面圖最為陡峭，說(shuō)明交互作用較其他交互作用顯著。

圖4 各因素交互作用的等高線與響應(yīng)面圖

3.2.4 提取工藝參數(shù)的驗(yàn)證 根據(jù)軟件分析計(jì)算，烏蘞莓的最佳醇提工藝為：加醇量12倍，提取時(shí)間2.48 h，乙醇濃度71.29%，理論計(jì)算綜合評(píng)分為1.001 56；為方便實(shí)驗(yàn)操作，將最佳工藝修正為：加醇量12倍，提取時(shí)間2.5 h，乙醇濃度70%。

稱取烏蘞莓飲片粉末5g，按照優(yōu)化的最佳醇提工藝提取，平行3份，得出干浸膏的得率分別為10.42%、10.44%、10.43%，平均得率為 10.43%；木犀草素含量分別為 0.32、0.32、0.32mg·g-1，平均含量為0.32mg·g-1；綜合得分為 0.98，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.2%，證明了回歸模型較為準(zhǔn)確可靠，優(yōu)化的醇提工藝具有可重復(fù)性和可操作性。

4 討 論

響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，可有效減少試驗(yàn)次數(shù)，與正交試驗(yàn)相比，響應(yīng)面法可根據(jù)二次方程模型分別做出試驗(yàn)因素間交互作用的等高線圖和三維立體響應(yīng)曲面，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀。BBD法是響應(yīng)面優(yōu)化法常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法之一，適用于2～5個(gè)因素的優(yōu)化，在因素相同時(shí)，BBD的實(shí)驗(yàn)次數(shù)更少，更經(jīng)濟(jì)[12]。BBD設(shè)計(jì)法每個(gè)因素取3個(gè)水平，以-1、0、1編碼。其設(shè)計(jì)表安排以0為中心點(diǎn)，+1、-1分別是立方點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的高值和低值。BBD優(yōu)化求解出的最優(yōu)工藝水平值不會(huì)超出最高值范圍，對(duì)某些有特殊需要或安全要求的實(shí)驗(yàn)尤為適用。

烏蘞莓軟膏在臨床長(zhǎng)期應(yīng)用于肛周膿腫、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及其他消腫止痛抗炎疾病，但現(xiàn)有工藝采用直接打粉入藥的方式，處理工藝粗糙，使用舒適度較差，藥物利用度低，且衛(wèi)生學(xué)很難達(dá)標(biāo)，反復(fù)滅菌又易致藥效成分不穩(wěn)定或損失，導(dǎo)致療效下降。本實(shí)驗(yàn)對(duì)烏蘞莓粉末的醇提工藝進(jìn)行研究，并采用BBD設(shè)計(jì)方法優(yōu)選烏蘞莓軟膏原料的最佳醇提工藝：加醇量12倍，提取時(shí)間2.5 h，乙醇濃度70%。希望通過(guò)優(yōu)化的提取方法改善以前工藝所存在的問(wèn)題。

對(duì)烏蘞莓軟膏原料的醇提工藝進(jìn)行優(yōu)選，改變其原打粉工藝，提高藥材的利用率，后期將進(jìn)行藥效學(xué)研究、優(yōu)選軟膏劑的制劑工藝并對(duì)烏蘞莓軟膏的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，以期提高烏蘞莓軟膏的質(zhì)量。