彭嘉勛，唐 平，翟詩圓，毛 雨，陳建芳

湖南工程學院化學化工學院，湖南湘潭 411101

利拉利汀（Linagliptin，1），商品名為 Trajenta，化學名為 8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮，是由勃林格殷格翰公司開發(fā)的一種高選擇性、競爭性的二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidaseⅥ，DPP-4）抑制劑。于2011年5月獲美國FDA批準上市，能有效治療2型糖尿病[1，2]。臨床研究顯示，利拉利汀單獨或與其他抗糖尿病藥（如二甲雙胍、磺酰脲類藥和唑烷二酮類藥）聯(lián)用均可降低低血糖的風險[2，3]。

目前文獻報道的利拉利汀合成工藝較多[4-6]，主要的合成方法是以3，7-二氫-3-甲基-1H-嘌啉-2，6-二酮為原料，經(jīng)過溴代反應、兩次取代反應得到中間體 8-溴-7-（2-丁炔基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基） 甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮，再與（R）-3-（叔丁氧羰基氨基）哌啶反應，經(jīng)脫保護得到利拉利汀。

本研究在參考利拉利汀的合成工藝與原料藥HPLC法分析的文獻時，發(fā)現(xiàn)了5個含量較多的可能雜質(zhì)成分[7-9]。它們分別為 8-[（3R）-3-乙酰氨基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基） 甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮（雜質(zhì) A）；8-[（3R）-3-甲酰胺基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮 （雜質(zhì)B）；8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-（7-（3-溴-2-丁烯基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮 （雜質(zhì) C）；8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-3，7-二氫-3-甲基-1-（2-丁炔基）-1H-嘌啉-2，6-二酮（雜質(zhì) D）；8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[（2-乙酰基）乙酰苯胺]-1H-嘌啉-2，6-二酮（雜質(zhì)E）。

利拉利汀在結(jié)構(gòu)上包含氨基哌啶片段，在生產(chǎn)過程中容易與乙酸或甲酸發(fā)生取代反應產(chǎn)生雜質(zhì)A或者雜質(zhì)B[4]。利拉利汀雜質(zhì)C是由于原料1-溴-2-丁炔純度不夠而產(chǎn)生的[5]。另外，在引入炔基結(jié)構(gòu)時，若沒有控制好反應物的投料比例，容易引入雜質(zhì)D[6]。在制備喹唑啉環(huán)過程中，如果關(guān)環(huán)反應不徹底，則帶來了雜質(zhì)E[6]。

為了對利拉利汀原料藥質(zhì)量控制提供雜質(zhì)對照品，本研究合成了上述疑似5個雜質(zhì)化合物。利拉利汀1與冰乙酸在40℃下發(fā)生酰化反應得到化合物A；利拉利汀1與甲酸乙酯在回流條件下發(fā)生取代反應得到化合物B；常溫下利拉利汀1在HBr-CH3COOH溶液中發(fā)生加成反應得到化合物C。化合物A、B、C的合成路線見圖1。

圖1 化合物A、化合物B和化合物C的合成路線

8-溴-7-（2-丁炔）-3-甲基黃嘌啉2在碳酸鉀的作用下與1-溴-2-丁炔發(fā)生取代反應得到中間體8-溴-7-（2-丁炔）-3-甲基-4-丁炔黃嘌啉 3；3 在碳酸鉀的作用下與（R）-3-Boc-氨基哌啶發(fā)生取代反應得到中間體 8-[3（R）-3-Boc-氨基哌啶]-7-（2-丁炔）-3-甲基-4-丁炔黃嘌啉4；4在三氟乙酸的作用下發(fā)生脫保護反應得到 8-[3（R）-3-氨基哌啶]-7-（2-丁炔）-3-甲基-4-丁炔黃嘌啉D。D的合成路線見圖2。

圖2 化合物D的合成路線

以鄰氨基苯乙酮為原料與氯乙酰氯發(fā)生取代反應得到中間體N-（2-乙酰基-苯基）-2-氯乙酰胺6；6在碳酸鉀的作用下與 8-溴-7-（2-丁炔）-3-甲基黃嘌啉2發(fā)生取代反應得到中間體8-溴-7-（N-（2-乙?；交┮阴０?2-基）-3-甲基-4-丁炔黃嘌啉7；7在碳酸鉀的作用下與2發(fā)生取代反應得到中間體8-[3 （R）-3-Boc-氨基哌啶]-7-[（丁-2-炔）-1-基]-3-甲基-1-[N-（2-乙?；交┮阴０?2-基]-黃嘌呤8；8在三氟乙酸的作用下發(fā)生脫保護反應得到 8-（3-氨基哌啶-1-基）-7-[（丁-2-炔）-1-基]-3-甲基-1-[N-（2-乙酰基苯基）乙酰胺-2-基]-黃嘌呤E。E合成路線見圖3。

圖3 化合物E的合成路線

1 儀器與試劑

BrukerAVANCE-500核磁共振儀（Bruker公司，TMS為內(nèi)標，以氘代CDCl3或氘代DMSO為溶劑）；LC-20A高效液相色譜儀 （日本島津公司）；薄層色譜采用薄層色譜硅膠板 （青島海洋化工廠）；Agilent液質(zhì)聯(lián)用單四極桿質(zhì)譜儀 （美國Agilent公司）；RY-Ⅰ型熔點測定儀 （天津市天分分析儀器廠），溫度計未經(jīng)校正。

硅膠粉（100～200目，青島海洋化工廠分廠），實驗所用試劑均為市售分析純。

2 合成方法

2.1 8-[（3R）-3-乙酰氨基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮（化合物A）的合成

將 1（1.2g，2.5mmol）溶于質(zhì)量分數(shù)為 40%的乙酸溶液（10mL）中，40℃下攪拌6h。反應結(jié)束后將反應液濃縮至干，經(jīng)硅膠柱層析分離純化（石油醚∶乙酸乙酯=1∶1，v/v），得到白色固體 2（1.2g，91.8%），m.p.283.0℃～283.4℃。純度99.2%[HPLC面積歸一法：色譜柱 AgilentC18（4.6nm × 150nm，5μm）；流動相A為磷酸鹽緩沖液 （2.0g磷酸二氫鈉加水1000mL溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.5），流動相B為甲醇-乙腈（55∶45，體積比）；柱溫：30 ℃；檢測波長：226nm；流速：1mL·min-1；進樣量：10μL；保留時間：7.5min]。

LC-MS（m/z）：515.3[M+H]+；1H-NMR（500MHz，DMSO） δ：1.80～1.87（m，9H，CC-CH3，piperidine-H），2.13～2.20（m，3H，COCH3），2.92（s，3H，C-CH3），3.01～3.08（m，2H，piperidine-H），3.63（s，3H，N-CH3），3.86～3.89（m，1H，CH），4.93（s，2H，CC-CH2），5.36（s，2H，N-CH2），7.71（s，1H，CO-NH），7.84～7.87（m，1H，Ph-H），7.95～7.98（m，2H，Ph-H），8.26～8.29（m，1H，Ph-H）；13C-NMR（125MHz，DMSO） δ：18.5，19.7，26.1，26.4，32.3，40.5，42.5，46.8，50.5，70.6，78.2，100.4，119.3，122.6，124.1，124.8，131.0，144.4，146.2，148.0，150.3，152.7，154.4，157.5，157.6，157.9，165.7。

2.2 8-[（3R）-3-甲酰胺基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮（化合物B）的合成

將 1（1.2g，2.5mmol）溶于二氯甲烷（20mL）中，再緩慢滴加甲酸乙酯（1.0mL，12.5mmol），回流條件下攪拌12h。反應完全后將反應液濃縮至干，經(jīng)硅膠柱層析分離純化 （石油醚∶乙酸乙酯=1∶1，v/v）， 得到白色固體 B （1.1 g，86.6%），m.p.281.5℃～281.8℃。純度99.0%（HPLC法條件同化合物A，雜質(zhì)B的保留時間為8.2min）。

LC-MS（m/z）：502.5[M+H]+；1H-NMR（500MHz，DMSO-d6） δ：1.74～1.87（m，9H，CC-CH3，piperidine-H），2.90 （m，3H，C-CH3），3.01～3.06 （m，2H，piperidine-H），3.54（s，3H，N-CH3），3.56～3.58（m，1H，piperidine-H），3.65～3.68（m，1H，CHO），4.92（s，2H，CC-CH2），5.35（s，2H，N-CH2），7.69（s，1H，NH），7.84（d，J=10.0Hz，1H，Ph-H），7.95～7.98（m，1H，Ph-H），8.24～8.28（m，2H，Ph-H）；13C-NMR（125MHz，DMSO） δ：17.5，19.7，26.1，26.4，32.2，40.5，42.5，46.8，50.5，70.6，85.8，100.3，107.7，119.4，122.0，123.8，125.5，125.8，144.4，146.0，147.9，150.1，150.4，152.7，157.9，165.7。

2.3 8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-（7-（3-溴-2-丁烯基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮（化合物C）的合成

將 1 （1.2 g，2.5mmol） 溶于 33%（質(zhì)量分數(shù)）的HBr-CH3COOH 溶液 （20 mL，HBr氣體溶解在CH3COOH中），回流條件下攪拌12h。反應結(jié)束后將反應液濃縮至干，經(jīng)硅膠柱層析分離純化（乙酸乙酯∶甲醇=20∶1，v/v），得到白色固體化合物 C（1.1 g，78.6%），m.p.258.9℃～260.3℃， 純度 99.5%（HPLC法條件同化合物A，化合物C的保留時間為18.5min。合成的化合物C經(jīng)HPLC考察，Rf值與原藥的雜質(zhì)C不一致，在以后的研究中將進一步觀察，見圖 4）。

圖4 5個合成品（A）和利拉利汀粗原料（B）的HPLC色譜圖

LC-MS（m/z）：553.2[M+H]+；1H-NMR（500MHz，DMSO-d6） δ：1.63～1.73（m，2H，piperidine-H），1.86～1.90（m，1H，CBr=CH-CH2），1.90～1.94（m，1H，piperidine-H），2.02～2.04（m，1H，piperidine-H），2.26（s，3H，C=CBr-CH3），2.92（s，3H，C-CH3），2.98～3.10（m，2H，piperidine-H），3.34（s，3H，N-CH3），3.41～3.45（m，2H，piperidine-H），3.68（d，J=15.0Hz，1H，piperidine-H），4.80 （s，2H，CC-CH2），5.36 （s，2H，N-CH2），6.11 （s，2H，NH2），7.72（d，J=10.0 Hz，1H，Ph-H），7.84（d，J=10.0Hz，1H，Ph-H），7.97 （d，J=10.0Hz，1H，Ph-H），8.28（d，J=10.0 Hz，1H，Ph-H）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6） δ：3.1，21.2，23.2，29.4，33.1，35.5，45.5，47.8，49.5，57.6，73.7，81.1，103.2，122.5，125.7，127.0，127.7，134.1，147.8，148.9，150.8，153.2，156.1，160.7，168.9。

2.4 8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-3，7-二氫-3-甲基-1-（2-丁炔基）-1H-嘌啉-2，6-二酮（化合物D）的合成

將 8-溴-7-（2-丁炔）-3-甲基黃嘌啉 2 （3.0 g，10.1mmol）溶于 N，N-二甲基甲酰胺（30mL）中，加入無水碳酸鉀（4.1 g，30.2mmol），再加入 1-溴-2-丁炔（1.4mL，15.5mmol），60 ℃下攪拌 6 h。反應畢，過濾，減壓濃縮反應液，經(jīng)硅膠柱層析分離純化（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，v/v），得到中間體 3（2.6g，73.8%）。1H-NMR （500MHz，DMSO-d6） δ：1.74（s，3H），1.80（s，3H），3.40（s，3H），4.55（s，2H），5.09（s，2H）。

將 3（2.0 g，5.7mmol）溶于 N，N-二甲基甲酰胺（20mL）中，加入無水碳酸鉀（2.3 g，17.1mmol），再加入（R）-3-Boc-氨基哌啶（1.7mL，8.6mmol），80 ℃下攪拌6 h。反應畢，過濾，減壓濃縮反應液，經(jīng)硅膠柱層析分離純化（乙酸乙酯∶甲醇=10∶1，v/v），得到中間體 4（1.9 g，70.7%）。

1H-NMR （500MHz，DMSO-d6） δ：1.38（s，9H），1.53～1.66（m，4H），1.66～1.71（m，4H），1.71～1.78（m，5H），2.83（t，J=10.5Hz，3H），2.87（t，J=10.5Hz，3H），3.45～3.57（m，2H），3.58～3.64（m，3H），4.52（s，2H），4.85（s，2H），6.97（d，J=7.5Hz，1H）。

將 4（1.0 g，2.1mmol）溶于二氯甲烷（15mL）中，向反應液中加入三氟乙酸 （0.2mL，3.2mmol），室溫下攪拌1 h。反應結(jié)束后，減壓濃縮反應液，經(jīng)硅膠柱層析分離純化（乙酸乙酯∶甲醇=20∶1，v/v），得到白色固體化合物 D（0.72 g，91.5%），m.p.180.5℃～180.8℃，純度99.5%（HPLC法條件同化合物A，化合物D的保留時間為19.5min）。

1H-NMR（500MHz，DMSO-d6）δ：1.43～1.53（m，4H，piperidine-H），1.69～1.76（m，5H，piperidine-H），2.63（t，J=10.5Hz，3H，C-CH3），2.98（t，J=10.5Hz，3H，C-CH3），3.31～3.36（m，2H，N-CH2），3.78（s，3H，CCH3），4.42（m，2H，N-CH2），5.95（s，2H，NH2）；13C NMR（125 MHz，DMSO-d6） δ：3.3，3.4，20.4，24.5，29.4，30.7，36.7，37.8，49.9，66.0，73.8，77.6，79.5，79.8，107.4，150.1，151.2，154.9，168.5。

2.5 8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3-甲基-1-[N-（2-乙?；交┮阴０?2-基]-1H-嘌啉-2，6-二酮（化合物 E）的合成

將 5（2.7 g，20.0mmol）溶于二氯甲烷（40mL）中，加入三乙胺（2.8mL，20.0mmol），常溫攪拌 30min后再加入氯乙酰氯（2.4mL，30.0mmol），常溫下攪拌8 h。反應結(jié)束后，減壓濃縮反應液，經(jīng)硅膠柱層析分離純化（石油醚∶乙酸乙酯=3∶1，v/v），得到 6（2.9 g，68.7%）。

將 6（2.0 g，9.5mmol）溶于 N，N-二甲基甲酰胺（30mL）中，加入碳酸鉀（1.3 g，9.5mmol），再緩慢加入 2（3.3 g，11.2mmol），50 ℃下攪拌 10 h。反應結(jié)束后，減壓濃縮反應液，用水和二氯甲烷萃取兩次。合并有機相，減壓濃縮，經(jīng)硅膠柱層析分離純化（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，v/v），得到 6（2.4 g，54.5%）。

1H-NMR（500MHz，DMSO-d6） δ：1.85（t，J=2.5Hz，3H），2.64（s，3H），3.50（s，3H），4.75（s，2H），5.15（d，J=2.5Hz，2H），7.10～7.39（m，1H），7.60～7.77（m，1H），8.05（d，J=8.5 Hz，1H），8.30（d，J=8.5 Hz，1H），11.53（s，1H）。

將 7（1.0g，2.1mmol）溶于二甲基亞砜（20mL）中，加入碳酸鉀（0.3 g，2.1mmol），再緩慢加入（R）-3-Boc-氨基哌啶（0.6 g，3.1mmol），50 ℃下攪拌 8 h。反應結(jié)束后，減壓濃縮反應液，用水和乙酸乙酯萃取兩次。合并有機相，減壓濃縮，經(jīng)硅膠柱層析分離純化（石油醚∶乙酸乙酯=5∶1，v/v），得到 8（0.76g，61.1%）。

1H-NMR （500 MHz，CDCl3） δ：1.41 （s，9H），1.44～1.47（m，1H），1.64（d，J=10.5 Hz，1H），1.75（s，3H），1.77～1.92（m，2H），2.55（s，3H），2.79～2.90（m，1H），2.99（s，1H），3.39（s，3H），3.57（s，1H），3.60（d，J=12.5Hz，1H），3.65（d，J=11.5Hz，1H），4.65（s，2H），4.85 （d，J=2.0Hz，2H），6.95 （d，J=7.5Hz，1H），7.12～7.27（m，1H），7.50～7.66（m，1H），7.95～7.98（m，1H），8.30（d，J=8.5Hz，1H）。

將 8（1.2g，2.0mmol）溶于二氯甲烷（20mL）中，滴加三氟乙酸（0.7mL，10.0mmol），常溫下攪拌 2h。反應結(jié)束后，減壓濃縮反應液，經(jīng)硅膠柱層析分離純化（乙酸乙酯∶甲醇=10∶1，v/v），得到白色固體雜質(zhì) E（0.7 g，72.1%），m.p.165.5℃～165.9℃，純度 99.1%（HPLC 法條件同化合物A，化合物E保留時間為15.0min）。

LC-MS（m/z）：492.2[M+H]+；1H-NMR（500MHz，DMSO-d6） δ：1.67～1.72（m，2H，piperidine-H），1.79（s，3H，COCH3），1.93～2.04 （m，2H，piperidine-H），2.59（s，3H，C-CH3），3.18～3.25（m，4H，piperidine-H），3.55～3.54 （m，3H，N-CH3），3.70 ～3.75 （m，1H，CH-NH2），4.68（s，2H，CC-CH2），5.02（s，2H，N-CH2），7.24（t，J=7.5Hz，1H，Ph-H），7.61（t，J=7.5Hz，1H，Ph-H），7.99（d，J=10.0Hz，1H，Ph-H），8.30（m，1H，Ph-H），11.49（s，1H，NH）；13C-NMR（125MHz，DMSO-d6） δ：18.7，24.1，25.5，26.4，32.3，41.1，42.9，47.0，48.1，70.4，78.2，100.4，117.4，120.1，121.2，121.9，128.5，131.0，135.3，144.4，147.6，149.8，152.3，163.6，199.5。

2.3 HPLC法對雜質(zhì)的確認

將合成的5個化合物混合后經(jīng)HPLC分離，同法將利拉利汀粗原料進行分離，結(jié)果見圖4?？梢娀衔?A、B、D、E 的 Rf值與粗品中雜質(zhì) A、B、D、E 的Rf值一致。

3 結(jié) 論

為控制藥品質(zhì)量，本研究合成了利拉利汀中常見的 4 種雜質(zhì)（A、B、D、E），提供給藥檢部門使用，具有一定的實際價值?；衔顲與原藥中雜質(zhì)C的結(jié)構(gòu)是否完全吻合將在未來進一步研究。