滿珈羽 ，焦菲菲 ，王逸雅 ，顧月清 ，舒 暢 **，丁 黎 **中國(guó)藥科大學(xué)，南京 0009；南京科利泰醫(yī)藥科技有限公司，南京 00

苯佐那酯軟膠囊具有療效好、不良反應(yīng)低、無(wú)成癮性等特點(diǎn)，被美國(guó)胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)推薦為治療癌癥病人咳嗽的首選藥物[1-5]。但是該藥目前尚未在中國(guó)上市，且國(guó)內(nèi)外沒(méi)有關(guān)于苯佐那酯藥代動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道，因此了解苯佐那酯軟膠囊中活性成分的濃度在中國(guó)健康受試者體內(nèi)的經(jīng)時(shí)變化過(guò)程對(duì)指導(dǎo)臨床用藥具有重大意義。再者，由于苯佐那酯是一種由15種聚合物單體組成的混合物，與代謝產(chǎn)物4-N-丁基氨基苯甲酸（BBA）間存在確定的量化關(guān)系。故本研究通過(guò)兩種HPLC-MS/MS法分別測(cè)定了血漿中原始BBA的濃度（方法B）和總BBA的濃度（包含原始BBA的濃度和由苯佐那酯轉(zhuǎn)化的BBA的濃度，方法A），根據(jù)總BBA濃度和原始BBA濃度的差值推算得到了血漿中苯佐那酯的濃度，并將其成功地應(yīng)用于中國(guó)健康受試者單次及多次口服苯佐那酯軟膠囊后的藥代動(dòng)力學(xué)研究。由于苯佐那酯會(huì)被基質(zhì)中的酯酶快速水解為BBA，因此將含藥全血樣品在室溫條件下放置2小時(shí)后離心，使苯佐那酯完全轉(zhuǎn)化為BBA，以檢測(cè)血漿中總BBA的濃度。為了檢測(cè)血漿中原始BBA的濃度，必須抑制苯佐那酯的轉(zhuǎn)化，因此在含藥全血樣品中加入酯酶抑制劑甲硫酸新斯的明[6]?，F(xiàn)將本研究主旨予以報(bào)道。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

苯佐那酯軟膠囊 （規(guī)格：100mg/粒、200mg/粒，批號(hào)：LC-B20170503、LC-B20170501， 石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司）；BBA對(duì)照品 （純度：99.7%，批號(hào)：2420-018A1，TLC）； 內(nèi)標(biāo)替米沙坦 （純度：99.6%，批號(hào)：100629-201202，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲硫酸新斯的明對(duì)照品 （批號(hào)：100550-200401，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

甲醇、乙腈（色譜純，Merck KGaA）；甲酸、醋酸銨（ACS，Sigma-Aldrich）；試驗(yàn)用水為超純水（Milli-Q制備）。

1.2 儀器與設(shè)備

島津高效液相色譜儀 （液相泵：LC-20ADXR，柱溫箱：CTO-20AC，控制器：CBM-20A Lite，脫氣機(jī)：DGU-20A5R，自動(dòng)進(jìn)樣器：SIL-30AC）；質(zhì)譜儀（API 4000，Applied Biosystems/Sciex），質(zhì)譜工作站（Analyst 1.6.2，Applied Biosystems/Sciex）；電子天平（Sartorius）；離心機(jī)（Thermo Fisher）等。

2 方 法

2.1 檢測(cè)條件

離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；離子極性：正離子；離子檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；碰撞氣壓力（CAD）：7Unit；氣簾氣壓力（CUR）：241.3 kPa；噴霧氣壓力 （GS1）：275.6 kPa；輔助加熱氣壓力（GS2）：275.6 kPa；離子噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550℃。BBA和替米沙坦的離子對(duì)分別為m/z194.2→138.1和m/z515.3→497.3。電參數(shù)設(shè)置見表1。

表1 BBA和替米沙坦的電參數(shù)

色譜柱：Agilent Poroshell 120 Phenyl Hexyl（2.1mm×50mm，2.7μm）； 柱溫：40℃； 流動(dòng)相：含0.3%甲酸和5mmol·L-1醋酸銨的水溶液-乙腈 （60∶40）；流速：0.3mL·min-1；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：8 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

方法A：精密稱取適量BBA對(duì)照品，用100%甲醇溶解配制成濃度為1.00mg·mL-1的BBA儲(chǔ)備液；用50%甲醇水溶液稀釋儲(chǔ)備液，配制不同濃度的BBA對(duì)照品工作溶液。精密稱取內(nèi)標(biāo)替米沙坦適量，用100%甲醇溶解成濃度為1.00mg·mL-1的替米沙坦儲(chǔ)備液；用50%甲醇水溶液稀釋，得到濃度為900ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)替米沙坦工作溶液。

方法B：BBA對(duì)照品儲(chǔ)備液、工作溶液及內(nèi)標(biāo)替米沙坦儲(chǔ)備液的配制方式和濃度與 “方法A”一致。用50%甲醇水溶液稀釋內(nèi)標(biāo)替米沙坦儲(chǔ)備液，配制成內(nèi)標(biāo)工作溶液，濃度為 60.0 ng·mL-1。精密稱取適量的甲硫酸新斯的明對(duì)照品，用超純水溶解，配制成濃度為10.0mg·mL-1的甲硫酸新斯的明儲(chǔ)備液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制

方法A：在室溫下，按1∶19的比例將BBA的工作溶液與空白血漿混合均勻，配制BBA的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品。其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品濃度為10.0、20.0、100、500、2 500、5 000、8 000、10 000 ng·mL-1，低、中、高質(zhì)控樣品的濃度為 25.0、250、7500ng·mL-1。

方法B：在冰浴條件下，按1∶19的比例將BBA的工作溶液與含甲硫酸新斯的明的空白血漿混合均勻，配制BBA的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品，濃度與“方法A”一致。此方法中含甲硫酸新斯的明的空白血漿是由含甲硫酸新斯的明儲(chǔ)備液的空白全血（25∶1000）離心所得。

2.4 樣品前處理

方法A：在96孔板中，加入50μL血漿樣品和30 μL 內(nèi)標(biāo)工作溶液（900 ng·mL-1）；渦旋 1min，向所有樣品孔中加入370μL甲醇；將密封的96孔板充分振搖 10min 后離心（10℃、4000 r·min-1，10min）；取30μL上清液加至含有570μL 40%甲醇水溶液干凈的96孔板中，渦旋混勻后進(jìn)樣分析。

方法B：在冰浴條件下，向含有800μL甲醇的EP管中加入100μL血漿樣品；振搖10min后在10℃條件下以12 000 r·min-1離心10min； 取30μL上清液加至含有540μL 40%甲醇水溶液的干凈的96孔板中；并向該96孔板中加入30μL內(nèi)標(biāo)工作溶液（60.0 ng·mL-1），渦旋混勻后進(jìn)樣分析。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)研究

本試驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，服從《赫爾辛基宣言》中規(guī)定的倫理原則。經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，臨床批件號(hào)為2016L06776。36名中國(guó)健康受試者（男女兼有），年齡18～45歲，自愿簽署知情同意書并經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室檢查合格后，平均分為 A、B、C 3 組，分別進(jìn)行低（100mg）、中（200mg）、高（400mg）劑量組的單次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究，以及中劑量組的多次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究。

A、B組受試者在空腹?fàn)顟B(tài)下分別單劑量口服1粒苯佐那酯軟膠囊 （100mg/粒、200mg/粒），C組受試者單劑量口服2粒苯佐那酯軟膠囊（200mg/粒）。于給藥前 （0 h） 和給藥后 0.167、0.333、0.5、0.667、0.833、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h 采 集 5 mL 全血。B組受試者單次給藥結(jié)束后，第2天開展多次給藥的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。連續(xù)兩天 （第2天和第3天），每天給藥3次（τ=6 h），第4天單次給藥苯佐那酯軟膠囊1粒。于第3天、第4天給藥前（0 h）和第4 天 藥 后 0.167、0.333、0.5、0.667、0.833、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h 采集 5mL 全血。 其中 2mL 推入至預(yù)冷的采血管B中（EDTA-K2抗凝且含50μL甲硫酸新斯的明儲(chǔ)備液），剩余3mL推入至采血管A中（EDTA-K2抗凝）。將采血管B立刻離心（10℃、4 000 r·min-1，10min）。并在冰浴條件下，取 100 μL離心得到的血漿樣品至含有800μL甲醇的EP管中，渦旋 10min 后離心（10 ℃、12 000 r·min-1，10min）獲取上清液，根據(jù)“方法B”檢測(cè)血漿中原始BBA的濃度。采血管A置于室溫條件下2 h后離心（10℃、4 000 r·min-1，10min），離心得到血漿樣品，根據(jù)“方法A”檢測(cè)血漿中總BBA的濃度。《美國(guó)藥典》指出，苯佐那酯和BBA的摩爾當(dāng)量相等[7]，因此，血漿中苯佐那酯的濃度可根據(jù)公式（1）計(jì)算。隨后，采用Win-Nonlin 6.4計(jì)算BBA和苯佐那酯的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。并通過(guò)WinNonlin 6.4和SPSS 19評(píng)價(jià)BBA和苯佐那酯的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

在公式（1）中，C表示濃度；MW表示相對(duì)分子質(zhì)量；MW苯佐那酯=603.74；MWBBA=193.24。

3 結(jié) 果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證[6]

方法A：此方法選擇性良好，分析物和內(nèi)標(biāo)間無(wú)干擾，且不存在殘留問(wèn)題；在 10.0～10 000 ng·mL-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，以BBA與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），以 BBC 質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，得典型的線性回歸方程為y=0.000 451 5C+0.000 270 4，r為 0.999 1；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為-2.0%～1.7%，精密度≤6.0%；內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子為95.6%～100.4%、回收率為86.5%～91.4%；BBA的全血樣品在室溫條件下放置3 h穩(wěn)定性良好；血漿樣品在室溫條件放置18.5 h穩(wěn)定性良好，-70℃條件下5次凍融循環(huán)穩(wěn)定性良好，-70℃條件下長(zhǎng)期冰凍27天、87天穩(wěn)定性良好；處理后待進(jìn)樣的溶液在自動(dòng)進(jìn)樣器（8℃）條件下放置8天穩(wěn)定性良好。

方法B：此方法選擇性良好，分析物和內(nèi)標(biāo)間無(wú)干擾；高濃度樣品進(jìn)樣后對(duì)下一針樣品的檢測(cè)不產(chǎn)生影響；典型的線性回歸方程為y=0.000 658 5C+0.000 190 6，r為 0.999 5；RSD 為-4.1%～2.0%， 精密度≤8.4%；內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子為98.5%～109.0%、回收率為98.7%～100.8%；苯佐那酯存在條件下BBA的全血樣品和血漿樣品在冰浴條件下放置2 h穩(wěn)定性良好；苯佐那酯存在條件下BBA的上清液樣品在室溫條件放置18.2 h穩(wěn)定性良好，-70℃條件下4次凍融循環(huán)穩(wěn)定性良好，-70℃條件下長(zhǎng)期冰凍27天、89天穩(wěn)定性良好；處理后待進(jìn)樣的溶液在自動(dòng)進(jìn)樣器（8℃）條件下放置9天穩(wěn)定性良好。

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)研究

3.2.1 單次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究 低 （100mg）、中（200mg）、高（400mg）劑量組受試者單次口服苯佐那酯軟膠囊后，血漿中BBA和苯佐那酯的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2、表3。

圖1 單次給藥后血漿中BBA（A）和苯佐那酯（B）的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

通過(guò)SPSS19對(duì)不同劑量組的Tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，對(duì)t1/2，CL/F和Vd/F進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明劑量對(duì)BBA和苯佐那酯的藥代動(dòng)力學(xué)特征均不產(chǎn)生影響（P＞0.05）。通過(guò) WinNonlin 6.4，以冪函數(shù)模型法（PK=α×doseβ）對(duì)苯佐那酯的 Cmax和 AUC0-10h進(jìn)行線性關(guān)系評(píng)價(jià)[8]，結(jié)果見表4。

3.2.2 多次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究 中劑量組（200mg）受試者多次口服苯佐那酯軟膠囊后，血漿中BBA和苯佐那酯的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2、表3。

通過(guò)SPSS19對(duì)BBA和苯佐那酯AUC0-τ進(jìn)行兩配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，多次給藥會(huì)使BBA和苯佐那酯在體內(nèi)的暴露量增加。根據(jù)蓄積常數(shù)公式計(jì)算得到 BBA 的 RCmax為 （1.20±0.45），RAUC為（1.10±0.13）； 苯佐那酯的 RCmax為 （1.24±0.57），RAUC為（1.31±0.33）。結(jié)果表明，多次給藥后BBA和苯佐那酯在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生蓄積[9]。

4 討 論

基于BBA和苯佐那酯間的量化關(guān)系，本研究首次提出了間接測(cè)定法，通過(guò)測(cè)定血漿中BBA的濃度推算出了血漿中苯佐那酯的濃度。獲得了BBA及苯佐那酯在體內(nèi)的經(jīng)時(shí)變化過(guò)程，估算了BBA和苯佐那酯的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，首次揭示了中國(guó)健康受試者口服苯佐那酯軟膠囊后體內(nèi)苯佐那酯及其代謝產(chǎn)物BBA的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

表2 BBA的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=12）

表3 苯佐那酯的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=12）

表4 線性評(píng)價(jià)結(jié)果

圖2 多次給藥后血漿中BBA（A）和苯佐那酯（B）的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

單次給藥試驗(yàn)結(jié)果表明，在100～400mg的給藥劑量范圍內(nèi)，苯佐那酯不具有線性藥代動(dòng)力學(xué)特征。多次給藥200mg苯佐那酯軟膠囊后，BBA在體內(nèi)的暴露量約增加9%，苯佐那酯在體內(nèi)的暴露量約增加25%。且多次給藥后BBA和苯佐那酯在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生蓄積。因此，在臨床連續(xù)用藥時(shí)需格外關(guān)注蓄積對(duì)藥效的影響。