劉美蓉 孟凡路 馬晴 顧立彥 鐘殿勝

隨著酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine-kinase inhibitor,TKI）類藥物的研發(fā)及在臨床的廣泛應(yīng)用，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）敏感突變的晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的客觀反應(yīng)率（objective response rate, ORR）、無進(jìn)展生存時(shí)間（progression-free survival, PFS）和總生存時(shí)間（overall survival, OS）都較單純化療有了顯著的提高。但仍有少部分EGFR敏感突變患者，服用TKI后無效。有學(xué)者將服用TKI后PFS＜90 d的患者稱為原發(fā)性耐藥[1]。目前，我們對(duì)原發(fā)性耐藥的分子機(jī)制知之較少，本文結(jié)合我科兩個(gè)原發(fā)性耐藥病例進(jìn)行分析。

1 病例分析

圖1 給予厄洛替尼前后肺、腰及腦部的影像學(xué)變化。A: 治療前；B：治療1個(gè)月后。Fig 1 Imaging changes of lung,waist and brain before and after treatment with erlotinib.A:Before treatment; B: One month after treatment.

圖2 給予TKI前后腹部及肺部的影像學(xué)變化。A: 治療前；B: 治療1個(gè)月后；C: 治療3個(gè)月后。Fig 2 Imaging changes of abdomen and lung before and after TKI.A: Before treatment;B: 1 month after treatment; C: 3 months after treatment.

1.1 病例一 男性，49歲，2016年1月無誘因出現(xiàn)左下肢近端疼痛，在當(dāng)?shù)毓强漆t(yī)院行腰椎影像學(xué)檢查，考慮“腰椎間盤突出”，給予對(duì)癥止痛治療，癥狀無明顯緩解。后因臍周脹痛，查全腹部增強(qiáng)計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）：“考慮急性胰腺炎，肝內(nèi)發(fā)現(xiàn)多發(fā)低密度結(jié)節(jié)影，性質(zhì)待定，左側(cè)腎上腺結(jié)節(jié)，考慮轉(zhuǎn)移可能性大；左側(cè)髂骨、髖臼、恥骨聯(lián)合左側(cè)面及左側(cè)恥骨支局部骨質(zhì)破壞，考慮轉(zhuǎn)移”。胸部CT顯示：“右上葉腫塊，縱隔內(nèi)多發(fā)輕度增大淋巴結(jié)，兩側(cè)胸腔積液”。頭部強(qiáng)化磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）檢查：“左側(cè)額葉、頂葉皮層異常強(qiáng)化灶，考慮轉(zhuǎn)移瘤；右側(cè)額葉異常強(qiáng)化灶，不除外轉(zhuǎn)移”；骨掃描（emission computed tomography, ECT）：“左側(cè)髖骨、股骨近端及右側(cè)肩胛骨異常示蹤劑濃集區(qū)，考慮轉(zhuǎn)移”；經(jīng)皮肺穿刺活檢，病理診斷：“非小細(xì)胞癌，傾向于腺癌，免疫組化染色示癌細(xì)胞呈CK7、NaspsinA、TTF-1和CK9陽性，CK20陰性”?；驒z測(cè)：“EGFR19外顯子缺失突變，ALK基因無重排，KRAS無突變”。給予厄洛替尼150 mgqd，1個(gè)月后，影像學(xué)見右肺上葉腫塊及左側(cè)腎上腺腫塊增大，新發(fā)小腦轉(zhuǎn)移，評(píng)估為疾病進(jìn)展（progressive disease, PD）（圖1），改為紫杉醇150 mg d1、d8，聯(lián)合卡鉑700 mg d1，每3周1次，化療2周期，評(píng)估肺部病變?nèi)詾檫M(jìn)展。建議患者再次活檢行基因檢測(cè)，患者放棄治療自動(dòng)出院，于2016年7月去世，OS 5個(gè)月。

1.2 病例二 男性，58歲，因“反復(fù)咳嗽、咳痰5個(gè)月，痰中帶血2個(gè)月”，2016年7月查胸部增強(qiáng)CT：“左肺下葉不規(guī)則分葉狀軟組織腫塊，腫塊緊貼鄰近降主動(dòng)脈及右下肺靜脈；左肺門、縱隔內(nèi)多發(fā)腫大淋巴結(jié)”； 正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像（positron emission computed tomography, PET）-CT：“左肺下葉后基底段軟組織腫塊影，代謝異常增高；雙頸部及胸部多發(fā)增大淋巴結(jié)、肝右葉后下段低密度結(jié)節(jié)影及體部多發(fā)骨質(zhì)密度不均，代謝異常增高，考慮為轉(zhuǎn)移”。頭部強(qiáng)化MRI未見轉(zhuǎn)移灶。支氣管鏡病理：“（左下葉后基底段-亞段開口）低分化癌”。經(jīng)皮肺穿刺活檢病理：“（左下肺）NSCLC，傾向腺癌”?；驒z測(cè)：“EGFR21外顯子L858R突變陽性；ALK基因無重排；KRAS無突變”?；颊邊⒓影？颂婺犭p倍劑量治療21外顯子突變晚期NSCLC的臨床研究，隨機(jī)到雙倍劑量組，口服?？颂婺?50 mg每日3次治療，1個(gè)月后復(fù)查胸部CT平掃：患者左肺下葉分枝狀腫塊較之前減小，部分緩解（partial response, PR）。服藥后3個(gè)月，患者咳嗽、咳痰加重，腹部及腰部疼痛明顯，再次入院評(píng)估，腫瘤全面進(jìn)展（圖2）。行血液基因檢測(cè)，結(jié)果：“EGFR21外顯子L858R突變陽性，豐度8%；無T790M突變”。換用培美曲塞、順鉑聯(lián)合貝伐珠單抗治療，2周期后評(píng)估，PR；繼續(xù)原方案化療3周期后，再次評(píng)估，PD，全身多發(fā)骨轉(zhuǎn)移較前增多?；颊叻艞壷委?，于2017年8月去世，OS 12個(gè)月。

2 討論

目前，我們對(duì)EGFR-TKI原發(fā)性耐藥分子機(jī)制的認(rèn)知還處于探索階段，研究表明，可能與以下分子機(jī)制有關(guān)。

2.1EGFR基因突變誘導(dǎo)的耐藥EGFR基因的敏感突變與耐藥突變共存，如20外顯子插入突變、T790M突變。EGFR20外顯子插入突變約占EGFR突變的4%，多位于EGFR酪氨酸激酶區(qū)768-774位氨基酸，其中770位插入突變最為常見。T790M突變是位于20號(hào)外顯子中第790蘇氨酸（T）突變?yōu)榧琢虬彼幔℅）。這些耐藥突變可以阻滯EGFRTKI與EGFR靶部位結(jié)合，導(dǎo)致原發(fā)性耐藥[2,3]。在AURA 3研究中[4]，他們發(fā)現(xiàn)對(duì)于有T790M的耐藥患者，奧西替尼是合適的治療選擇。此外，在BELIEF研究中[5]，入組的EGFR敏感突變NSCLC，給予厄洛替尼聯(lián)合貝伐單抗治療，亞組分析顯示，同時(shí)伴有T790M突變的患者，PFS為16.0個(gè)月，提示，第一代EGFR-TKI聯(lián)合抗血管生成治療可以用于EGFR敏感突變伴有T790M突變的NSCLC患者。再有，Poziotinib顯示出對(duì)EGFR20外顯子插入突變的NSCLC有效[6]。Poziotinib在EGFR20外顯子突變的細(xì)胞系Ba/F3中，IC50值為1.0 nmol/L，有效性是阿法替尼的40倍。在MD安德森癌癥中心進(jìn)行的II期臨床研究中，11例EGFR 20外顯子插入突變的NSCLC患者接受Poziotinib治療，ORR為64%，隨訪期6.5個(gè)月，中位OS仍未達(dá)到，使得臨床醫(yī)生對(duì)Poziotinib充滿了期待。

2.2 EGFR通路下游基因突變誘導(dǎo)的耐藥 EGFR通路下游基因，如KRAS、Braf、PIK3CA等同樣可以發(fā)生突變。這些突變可導(dǎo)致RAS-RAF-MAPK和/或PI3K-AKT通路持續(xù)激活，且不受上游EGFR的調(diào)控，所以，TKI雖阻斷上游通路，但下游通路仍持續(xù)活化，因此，導(dǎo)致EGFR-TKI原發(fā)性耐藥[7-9]。針對(duì)這一耐藥機(jī)制的治療藥物數(shù)據(jù)尚不成熟。BGB-283是RAF抑制劑[10]，對(duì)RAF二聚體的抑制作用增加，可同時(shí)阻斷RAF和EGFR。來自中國的一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)中[11]，BGB-283對(duì)RAF突變的肺癌，ORR是16.7%，疾病控制率達(dá)50%。肺癌中BRAF單突變頻率約為2%-4%，在一項(xiàng)II期研究中[12]，78例經(jīng)治的RAF突變晚期NSCLC患者，BRAF抑制劑達(dá)拉非尼ORR 33%，中位PFS 5.5個(gè)月，中位OS 12.7個(gè)月。6例初治患者中，4例達(dá)到PR。韓國的一項(xiàng)研究[13]納入了136例EGFR敏感突變，并且接受EGFRTKI治療的患者，其中TKI原發(fā)性耐藥的患者20例，對(duì)原發(fā)性耐藥患者的組織進(jìn)行了基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TP53突變最為常見，占47%；SMAD4占19%，DDR216%，PIK3CA15%，STK1114%，BRAF7%。發(fā)生在PI3K/Akt/mTOR通路的基因突變，TKI治療的ORR為27%，突變組和無突變組PFS分別為2.1個(gè)月和12.8個(gè)月。提示該通路的基因發(fā)生突變，可能是原發(fā)性耐藥的原因之一。

2.3 其他基因誘導(dǎo)的耐藥MET基因改變、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）重排等其他異常也可以激活EGFR-TKI原發(fā)性耐藥[14,15]。肝細(xì)胞生長因子受體（hepatocyte growth factor receptor, HGFR）是MET編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，與配體HGF結(jié)合后可以啟動(dòng)下游信號(hào)通路。在EGFR-TKI原發(fā)性耐藥的腺癌細(xì)胞系中，HGF呈現(xiàn)出異常高表達(dá)。而棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4（echinoderm micmtubule associated protein like 4, EML41）和ALK融合而形成EML4-ALK基因重排，其編碼蛋白可形成非配體依賴性二聚體，活化ALK進(jìn)而激活RAS-MEKERK，JAK3-STAT3和PI3K-AKT等信號(hào)通路。據(jù)廣東省人民醫(yī)院公布的對(duì)2,632例NSCLC患者的研究[16]，EGFR和ALK雙突變患者共16例，占0.6%。此外，胰島素樣生長因子受體（insulin-like growth factor receptor, IGFR）、層粘連蛋白（Laminin, LN1）過表達(dá)也可引起的EGFR旁路激活，導(dǎo)致TKI原發(fā)性耐藥[17]。

另外，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白相互作用的細(xì)胞凋亡中介物（BCL-2 interacting mediator of cell death, BIM）的缺失多態(tài)性可能也與EGFR-TKI耐藥相關(guān)。一項(xiàng)韓國針對(duì)NSCLC患者的調(diào)查研究顯示[18]，BIM缺失多態(tài)性為19%（61/541）。而上海肺科醫(yī)院的調(diào)查顯示[19]，12.8%（45/352）的NSCLC患者存在BIM缺失多態(tài)性，這部分患者對(duì)EGFR-TKI的ORR為25%，PFS 4.7個(gè)月；多因素分析顯示，BIM缺失多態(tài)性是EGFR突變預(yù)后差的獨(dú)立預(yù)后因子。Xia等[20]的研究再次驗(yàn)證了BIM缺失多態(tài)性與EGFR突變患者不良預(yù)后相關(guān)，245例NSCLC患者中BIM缺失多態(tài)性的發(fā)生率是12.24%，EGFR-TKI治療的ORR 16%，BIM野生型ORR 91%，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 microRNA與耐藥 microRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。一項(xiàng)對(duì)比了EGFR-TKI原發(fā)性耐藥患者血漿中miRNA水平的研究[21]顯示，在原發(fā)性耐藥組有15種miRNA下調(diào)，包括hsv2-miR-H19、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-3196、hsa-miR-3153、hsa-miR-4791、hsa-miR-4803、hsa-miR-4796-3p、hsa-miR-372-5p、hsa-miR-138-2-3p、hsa-miR-16-1-3p、hsa-miR-1469、hsa-miR-585-3p、ebv-miR-BART14-5p、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-548aq-5p，1種miRNA上調(diào)，hsamiR-503-3p。上述miRNA可能通過調(diào)控MYC、CCND1等靶基因誘發(fā)EGFR-TKI原發(fā)性耐藥。

文獻(xiàn)[1,22]中報(bào)道，EGFR-TKI原發(fā)性耐藥的發(fā)生率為5%-20%，而EGFR敏感突變合并上述耐藥突變的發(fā)生率均小于1%，所以上述分子機(jī)制不能完全解釋原發(fā)性耐藥的原因。本文中所報(bào)道的兩例病例，EGFR-TKI治療前未檢測(cè)出上述耐藥突變；其中第二例患者在耐藥后敏感突變?nèi)源嬖?，也未發(fā)現(xiàn)相關(guān)耐藥突變，這可能與我們基因檢測(cè)的數(shù)量和方法有關(guān)。對(duì)這兩例患者，我們僅進(jìn)行了包括EGFR在內(nèi)的3個(gè)-8個(gè)基因的檢測(cè)，使用了ARMS等常規(guī)方法。NGS的方法雖然敏感度高，且可以平行進(jìn)行多基因突變檢測(cè)，但目前還未被指南推薦用于臨床實(shí)踐。近年來，血液ctDNA檢測(cè)取得了很大的進(jìn)展，王潔等[23]進(jìn)行的BENEFIT研究顯示，ddPCR檢測(cè)的ctDNA EGFR突變指導(dǎo)的一線吉非替尼治療的客觀有效率為72.1%，中位PFS為9.5個(gè)月；同時(shí)利用NGS技術(shù)分析了多基因的變異，11.7%患者還攜帶其他基因變異，如MET、ERBB2、KRAS、BRAF、RET、ROS1、TP53、RB1、PTEN等；如合并其他基因突變，PFS僅3.9個(gè)月。但血液檢測(cè)存在假陰性等問題，目前不能替代組織學(xué)檢測(cè)，在2018年《中國EGFR突變血檢共識(shí)》也只推薦了EGFR檢測(cè)，方法為AMRS或者Super-ARMS。

總之，EGFR-TKI原發(fā)性耐藥的機(jī)制與繼發(fā)性耐藥不同，耐藥分子機(jī)制的多樣性為治療帶來更多困難。在日常臨床實(shí)踐中，基因檢測(cè)的數(shù)量及其方法均可影響對(duì)患者EGFR-TKI原發(fā)性耐藥的判斷和探索。