侯躍龍 郭洪琦 郭永寬 張玉坤 韓洪利

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是最為常見(jiàn)的一種肺癌類(lèi)型，其發(fā)病率約占肺癌患者的85%[1]。由于NSCLC發(fā)病隱匿，缺乏早期篩查的特異性標(biāo)志物，多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期階段，常伴隨淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其5年生存率較低，預(yù)后也不理想。研究認(rèn)為，通過(guò)對(duì)NSCLC高危人群進(jìn)行有效篩查，確立早期NSCLC發(fā)病人群并采取有效的治療措施，可以顯著提高NSCLC病患的生存率，改善其預(yù)后[2]。多年來(lái)，大量的科學(xué)研究關(guān)注于多種腫瘤生物標(biāo)志物的探索和開(kāi)發(fā)[3-5]，但目前臨床對(duì)于早期NSCLC患者的篩查，尚缺乏特異性標(biāo)志物的輔助診斷。

多肽組學(xué)是一種分析多肽鏈結(jié)構(gòu)、功能及其變化規(guī)律的組學(xué)技術(shù)，是蛋白1組學(xué)的深入補(bǔ)充。近年來(lái)，越來(lái)越多的科研工作者嘗試?yán)枚嚯慕M學(xué)技術(shù)，對(duì)各類(lèi)疾病進(jìn)行早期篩查和預(yù)后評(píng)估，并發(fā)現(xiàn)了一系列生物標(biāo)志物[6-8]。因此，本文旨在通過(guò)血清多肽組學(xué)分析技術(shù)，比較正常健康人群、肺部良性病變患者、早期NSCLC患者血清中的差異多肽片段，篩選和鑒定早期NSCLC患者的腫瘤生物標(biāo)志物，從而以新的角度為NSCLC的早期診斷提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2016年9月-2017年9月天津市第三中心醫(yī)院住院收治的27例初診NSCLC早期患者的血清樣本，患者中位年齡61.5歲（50歲-74歲），其中男性17例、女性10例，肺癌術(shù)后TNM分期：Ia期-IIb期，分型包括12例鱗癌、12例腺癌、1例腺鱗癌、2例大細(xì)胞癌。同時(shí)收集26例肺部良性病變患者的血清樣本，年齡54.7歲（36歲-69歲），其中男性16例、女性10例，良性病類(lèi)型包括肺囊腫、結(jié)核球、機(jī)化性肺炎、硬化性血管瘤、炎性假瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、肉芽腫炎及非典型腺瘤樣增生。另外采集14例健康體檢人群的血清樣品，年齡52（21歲-59歲），其中男性8例、女性6例（表1）。所有NSCLC組和良性組患者在血清樣本采集前均未進(jìn)行手術(shù)、放化療及介入等治療，且術(shù)后均得到明確的病理學(xué)證實(shí)。所有納入實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 樣本分組與前處理 將血清樣本分為三組：分別為正常對(duì)照組（Normal組）、良性病變組（Benign組）、早期NSCLC組（Cancer組），根據(jù)每組的樣本數(shù)，進(jìn)行多樣本混合，使每組有3個(gè)混合生物樣本（表2），取混合好的樣本50 μL加入等量的標(biāo)準(zhǔn)肽，而后加入200 μL的20%乙腈（含50 mmol/L NH4HCO3），4 ℃靜置5 min，將樣本過(guò)10 kD濾膜后，低溫超速離心30 min（4 ℃、10,000 g），加入終濃度5 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT），30 ℃震蕩30 min，加入10 mmol/L碘乙酰胺（IAM），避光保存45 min，使用C18 tip柱對(duì)樣本進(jìn)行除鹽，真空離心抽干，使用液相流動(dòng)相A復(fù)溶，離心后轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，待測(cè)。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè) 將各組檢測(cè)樣品在納升超高效液相色譜系統(tǒng)（Ultimate RSLCnano 3000，美國(guó)Dionex公司）中進(jìn)行色譜分析，柱溫箱溫度為50 ℃，流速為500 μL/min，梯度洗脫程序：在65 min內(nèi)調(diào)控流動(dòng)相B由5%升至60%（V/V）。質(zhì)譜分析采用四級(jí)桿軌道阱質(zhì)譜（Q Exactive plus，美國(guó)Thermo Scientific公司），噴霧電壓為2.4 kV，毛細(xì)管溫度為320 ℃，質(zhì)譜掃描方式首先采用譜圖計(jì)數(shù)法對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組樣本中可能存在的差異肽段進(jìn)行鑒定及初步篩選，而后采用非數(shù)據(jù)依賴(lài)型數(shù)據(jù)采集技術(shù)（dataindependent acquisition, DIA）對(duì)初步篩選結(jié)果進(jìn)行定量分析和再次驗(yàn)證。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析 首先使用Proteome Discoverer軟件將質(zhì)譜文件轉(zhuǎn)換成Mascot軟件的輸入格式，而后通過(guò)Mascot 2.3軟件與人類(lèi)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)（Swissprot_Human）進(jìn)行比對(duì)，對(duì)各組血清樣本中的多肽進(jìn)行鑒定。在Mascot導(dǎo)出的結(jié)果中，對(duì)每個(gè)肽段鑒定到的譜圖數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，取各組中每個(gè)肽段譜圖數(shù)的平均值進(jìn)行比較，按譜圖數(shù)變化1.5倍及以上為域值，篩選差異目標(biāo)肽段。在Mascot鑒定結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Skyline軟件抽提出目標(biāo)肽段的母離子與子離子峰，排除質(zhì)量偏差較大的子離子/母離子，計(jì)算各離子在每組3個(gè)混合樣品中的CV，CV越小表示重復(fù)性越好，以CV≤30%作為篩選閾值，并比較各離子的質(zhì)譜峰面積，按峰面積變化1.5倍及以上為域值，驗(yàn)證差異目標(biāo)肽段。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜檢測(cè)與質(zhì)量監(jiān)控 本次實(shí)驗(yàn)對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中9個(gè)混合樣本進(jìn)行了質(zhì)譜檢測(cè)，為了監(jiān)控每個(gè)樣本提取及質(zhì)譜運(yùn)行的平行性，在提取前的樣本中加入了等量的重標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)肽GLQAQGYGVR，使用DIA數(shù)據(jù)在Skyline軟件中可以直觀的看到標(biāo)準(zhǔn)肽在不同樣本中的最終含量差異，將標(biāo)準(zhǔn)肽在各樣本中的峰面積進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各組間無(wú)顯著差異，提示樣本提取及質(zhì)譜檢測(cè)的平行性較好。

2.2 多肽鑒定及譜圖計(jì)數(shù)結(jié)果 通過(guò)與人類(lèi)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，本次實(shí)驗(yàn)在9個(gè)混合樣本中，共鑒定到545個(gè)多肽，分別來(lái)自于118個(gè)蛋白（表3）。取各組中肽段譜圖數(shù)的平均值，作為該肽段在本組樣本中的譜圖數(shù)，并以譜圖數(shù)變化1.5倍及以上（≥1.5或≤0.67）為域值，共篩選出201個(gè)差異多肽，作為下一步DIA定量分析的目標(biāo)肽段。

2.3 基于DIA技術(shù)的定量分析結(jié)果 針對(duì)Skyline軟件得到的目標(biāo)肽段母離子與子離子的色譜峰，進(jìn)行人工確認(rèn)后導(dǎo)出定量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將質(zhì)量偏差大于20 ppm的離子去除，并計(jì)算各離子在每組中的CV，以CV≤30%為閾值，以峰面積變化1.5倍及以上為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異多肽。與Normal組相比，Cancer組共發(fā)現(xiàn)28個(gè)差異表達(dá)多肽；與Normal組相比，Benign組共發(fā)現(xiàn)34個(gè)差異表達(dá)多肽；與Benign組相比，Cancer組共發(fā)現(xiàn)20個(gè)差異表達(dá)多肽（表4）；在各組比較中，滿(mǎn)足CV≤30%的差異肽段共有7個(gè)，分別來(lái)自于中間α球蛋白抑制因子H4蛋白（ITIH4）、基質(zhì)γ-羧基谷氨酸蛋白（MGP）、高遷移率族蛋白N2（HMGN2）、胸腺細(xì)胞同種異形抗原（TTHY）、膠原蛋白4α亞基（CO4A）、纖維蛋白原α鏈（FIBA）蛋白（表4），其中在各組間呈趨勢(shì)表達(dá)變化的有2條肽段，分別是Cancer組中表達(dá)下調(diào)的ITIH4水解肽段QGAKIPKPEASFSPR和Cancer組表達(dá)上調(diào)的MGP水解肽段CDDYRLC。

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的一類(lèi)惡性腫瘤，其發(fā)病率、病死率一直居高不下[9]肺癌患者的病理分型中85%屬于NSCLC，其臨床治療原則為“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”。大多數(shù)早期發(fā)病的NSCLC患者（TNM分期：I期-II期），在根治性手術(shù)治療后，都能獲得較好的預(yù)后。但NSCLC通常具有發(fā)病隱匿、進(jìn)展快速、缺乏特異性腫瘤標(biāo)志物等特點(diǎn)[10]，尤其是針對(duì)NSCLC人群的早期篩查，尚缺乏能夠用于臨床診斷的血清標(biāo)志物。因此，關(guān)于篩選NSCLC早期生物標(biāo)志物的研究，對(duì)于提高其生存率和改善其預(yù)后，都將具有十分重要的意義。

表1 各組受試者的臨床病例特征Tab 1 Clinical and pathologic characteristics in each group

表2 實(shí)驗(yàn)分組與樣本混合Tab 2 Experiment grouping design and mixed samples

多肽組學(xué)是一門(mén)針對(duì)多肽鏈結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系的新興組學(xué)技術(shù)，其填補(bǔ)了蛋白組學(xué)與代謝組學(xué)之間的空隙，正逐漸受到醫(yī)學(xué)界的高度重視[11,12]。越來(lái)越多的科研人員嘗試通過(guò)多肽組學(xué)分析，對(duì)各類(lèi)疾病的生物標(biāo)志物進(jìn)行篩選和鑒定，其應(yīng)用領(lǐng)域涵蓋肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤以及風(fēng)濕、哮喘和阿爾茲海默癥等非腫瘤疾病[13-17]。DIA是目前世界上最前沿的非標(biāo)記型、兼具蛋白質(zhì)鑒定和相對(duì)定量功能的質(zhì)譜分析技術(shù)，其最大優(yōu)點(diǎn)是無(wú)縫的采集所有碎片信息，避免傳統(tǒng)數(shù)據(jù)采集掃描時(shí)的數(shù)據(jù)丟失，且由于DIA可以根據(jù)各種離子（母離子與子離子）強(qiáng)度綜合評(píng)定差異多肽含量，較僅分析母離子的傳統(tǒng)數(shù)據(jù)采集技術(shù)更為精確和全面[15]。目前，關(guān)于NSCLC早期篩查的多肽組學(xué)研究還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)，利用譜圖計(jì)數(shù)法對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組中可能存在的差異肽段進(jìn)行鑒定及初步篩選，使用較寬松的篩選條件，舍棄在大部分樣本中沒(méi)有鑒定到或不存在明顯差異的肽段，而后通過(guò)DIA技術(shù)對(duì)初篩的差異多肽進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，從而對(duì)初步的鑒定結(jié)果進(jìn)行明確驗(yàn)證，旨在探尋NSCLC早期診斷的血清生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，在各組比較中，滿(mǎn)足峰面積CV≤30%（最嚴(yán)格的篩選模式）的差異肽段共有7個(gè)，分別來(lái)自于ITIH4、MGP、HMGN2、TTHY、CO4A、FIBA蛋白，而這些蛋白大多被證實(shí)是腫瘤組織中重要的調(diào)控蛋白。我們實(shí)驗(yàn)組會(huì)在以后的試驗(yàn)中進(jìn)一步研究和探討。其中最具有臨床指導(dǎo)意義的是在各組間呈趨勢(shì)變化的2條肽段，分別是在Normal組、Benign組及Cancer組中表達(dá)逐漸降低的肽段QGAKIPKPEASFSPR和表達(dá)逐漸升高的肽段CDDYRLC，二者分別來(lái)源于ITIH4和MGP蛋白。

表3 各組樣本中多肽的鑒定Tab 3 Identification of polypeptides in each group

表4 各組樣本中差異多肽片段的數(shù)量Tab 4 The number of differentially expressed polypeptides in each group

ITIH4是一種由肝臟合成的調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)分泌和形成的重要血清糖蛋白，屬于胰蛋白酶抑制物家族。目前發(fā)現(xiàn)，ITIH4異常低表達(dá)可能是多種癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志。研究表明，肝癌細(xì)胞中ITIH4表達(dá)水平顯著降低，而過(guò)表達(dá)調(diào)控后可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移，并且發(fā)現(xiàn)ITIH4高表達(dá)水平的肝癌患者通常具有較好的預(yù)后[16]，提示ITIH4與肝癌的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也提示ITIH4從正常人到良性疾病再到肺癌中表達(dá)逐漸降低，提示其低表達(dá)是NSCLC的一種標(biāo)志，于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致?？赡艿脑蚴荌TIH4在腫瘤組織中的調(diào)控作用可能與其裂解肽段有關(guān)，其羧基端的多聚脯氨酸區(qū)域常出現(xiàn)大量蛋白裂解片段，而這些裂解過(guò)程主要參與對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的水解破壞，使細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)由于降解而塌陷，從而形成癌細(xì)胞惡性侵襲的通道，使其大量通過(guò)并浸潤(rùn)到癌旁組織中，最終促成腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。

目前認(rèn)為，MGP是一種抑制礦鹽沉積的蛋白，可以通過(guò)與骨形態(tài)蛋白2（BMP2）結(jié)合，抑制其誘發(fā)的成骨反應(yīng)和血管鈣化[18]，而MGP的生物學(xué)功能主要依賴(lài)于其肽段水解后的非磷酸化修飾[19]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，BMP2與肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]，提示MGP也可能是一種肺癌生物標(biāo)志物。Zandueta等[21]研究表明，在人骨肉瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移過(guò)程中，MGP的表達(dá)水平顯著升高，且MGP通過(guò)激活基質(zhì)金屬蛋白酶活性和TGFβ誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化信號(hào)通路，參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞粘附和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。與上述研究一樣，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也提示在NSCLC中MGP的表達(dá)明顯升高，提示可能是一種NSCLC的肺癌標(biāo)記物。

表5 各組樣本中峰面積變異系數(shù)≤30%的差異多肽Tab 5 The differentially expressed polypeptides with the CV of peak area less than 30%

綜上所述，ITIH4與MGP蛋白的水解過(guò)程可能對(duì)腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用，其裂解修飾的特異性肽段QGAKIPKPEASFSPR和CDDYRLC可能是潛在NSCLC患者血清中重要的生物標(biāo)志物，可用于早期肺癌臨床篩查，但由于本實(shí)驗(yàn)是基于肺癌多肽組學(xué)的初步研究，在樣本量、病理分型等方面的局限性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。