尤 潤，王玲玲，曹璐瑤，廖文軒，邢夢雪，王文秀，鐘麗萍，鄭麗麗，肖祖飛*

（南昌工程學(xué)院水利與生態(tài)工程學(xué)院，江西南昌 330099）

華木蓮（Sinomanglietia glauca）是1988年在江西省宜春明月山首次發(fā)現(xiàn)，1994年俞志雄發(fā)表該樹種，并建立華木蓮屬[1]。華木蓮，木蘭科落葉喬木，樹干通直，樹形優(yōu)美，花香沁人心脾近乎幽蘭，花色淡黃典雅宛若睡蓮，金秋碩果累累，分布于江西和湖南個別地方，是我國特有珍稀瀕危樹種，也是優(yōu)良的園林綠化樹[2]。以華木蓮一年生半木質(zhì)化枝條為材料，研究消毒時間、基本培養(yǎng)基和激素對華木蓮莖段組織培養(yǎng)的影響，旨在為更好保護、開發(fā)與利用瀕危物種華木蓮。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來自南昌工程學(xué)院木蘭園的華木蓮。2015年6 月份選取生長健壯的華木蓮植株，剪取當年生半木質(zhì)化枝條，將枝條修剪成帶1～2 個芽的莖段，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 消毒時間對華木蓮莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響。將修剪好的莖段放入無菌罐頭瓶，75%酒精中浸泡30s，用無菌水沖洗3～5 次，用0.1%的氯化汞（HgCl2）進行消毒，消毒時間分別為5、6、7、9 和12min，用無菌水沖洗3～5次，莖段放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種在MS+1.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA 培養(yǎng)基，每個處理30 瓶，每瓶1～2 個莖段。

1.2.2 基本培養(yǎng)基對華木蓮莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響。將修剪好的莖段放入無菌罐頭瓶，75%酒精中浸泡30s，用無菌水沖洗3～5 次，再用0.1%的氯化汞進行消毒7min，用無菌水沖洗3～5 次，莖段放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種在DCR 和MS 基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基添加1.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA。每個處理60 瓶，每瓶1～2 個莖段。

1.2.3 激素濃度對華木蓮莖段萌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響。將修剪好的莖段放入無菌罐頭瓶，75%酒精中浸泡30s，用無菌水沖洗3～5 次，再用0.1%的氯化汞進行消毒，消毒時間分別為7min，用無菌水沖洗3～5 次，莖段放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種在MS 培養(yǎng)基，添加6-BA（0.5mg/L、1.00mg/L、1.50mg/L、2.00mg/L、3.00 mg/L），IBA （0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L）。每個處理20 瓶，每瓶1～2 個莖段。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel2010 軟件進行數(shù)據(jù)的錄入、整理和方差分析。主要調(diào)查指標如下：存活率（%）=（存活的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）×100；污染率（%）=（污染的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）×100；褐化率（%）=（褐化的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）×100；萌芽率（%）=（萌芽的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）×100；愈傷率（%）=（誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對華木蓮莖段培養(yǎng)的影響

由表1 和圖1 可知，隨著消毒時間的增加，華木蓮莖段組織培養(yǎng)污染率逐漸降低，華木蓮莖段消毒5min，污染率超過50%，與消毒6min 差異不顯著，顯著高于消毒7min、9min 和12min，消毒9min 和12min，污染率均低于20%。隨著消毒時間的增加，褐化率逐漸升高，華木蓮莖段消毒5min 和6min，褐化率較低，低于10%，之間差異不顯著；消毒7min，褐化率較低，為15.63%；消毒時間超過9min，褐化率顯著提高，顯著高于5min、6min 和7min。隨著消毒時間的增加，存活率和萌芽率呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢。消毒7min，存活率和萌芽率達到最大值，分別為31.25%和20.63%，顯著高于其它消毒時間。因此，華木蓮莖段組織培養(yǎng)消毒最佳時間為7min。

表1 消毒時間對華木蓮莖段培養(yǎng)的影響

2.2 基本培養(yǎng)基對華木蓮莖段培養(yǎng)的影響

圖1 華木蓮莖段組織培養(yǎng)，由左至右依次為莖段萌芽、污染和褐化

選擇適當?shù)幕九囵B(yǎng)基，對于組織培養(yǎng)成功至關(guān)重要。由表2 可知，華木蓮莖段組織培養(yǎng)采用MS 培養(yǎng)基褐化率低于DCR 培養(yǎng)基，存活率、愈傷率和萌芽率高于DCR 培養(yǎng)基，之間差異顯著。采用MS 培養(yǎng)基，莖段容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織（圖2），腋芽萌芽也較快。因此，華木蓮莖段組織培養(yǎng)適宜基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基。

2.3 不同激素濃度對華木蓮莖段培養(yǎng)的影響

表2 不同基本培養(yǎng)基對華木蓮莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

圖2 不同基本培養(yǎng)基對華木蓮莖段培養(yǎng)的影響左圖為MS 培養(yǎng)基，右圖為DCR 培養(yǎng)基

由表3 可知，在IBA 濃度不變的情況下，隨著6-BA 濃度的增加，華木蓮莖段的萌芽率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。處理3 和處理5，華木蓮莖段萌芽率最高，分別為26.50%和28.67%，之間差異不顯著，顯著高于其它處理，處理3 腋芽萌芽較快，芽粗壯，葉片舒展，切口有較多愈傷組織形成，而處理5 可能6-BA 濃度過高，芽、葉片呈水漬狀；其次是處理4，萌芽率為23.67%；萌芽率較低的是處理1 和處理2，萌芽率分別為9.33%和15.28%。在6-BA 濃度不變，華木蓮莖段的萌芽率隨著IBA 濃度的增加呈現(xiàn)先升后降趨勢，處理7 誘導(dǎo)腋芽萌芽率最高，為29.83%，顯著高于其它處理，且腋芽萌芽快，芽粗壯，切口愈傷組織較多。因此，華木蓮莖段誘導(dǎo)腋芽萌芽最適激素配比為MS +1.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L IBA。

繼代培養(yǎng)結(jié)果表明，華木蓮難以誘導(dǎo)芽的增殖（圖3），可能與自身的遺傳因素有關(guān)。

表3 激素配比對華木蓮莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

圖3 華木蓮莖段繼代培養(yǎng)的影響

組織培養(yǎng)具有操作簡單、繁殖系數(shù)高、脫毒、可周年生產(chǎn)等優(yōu)點，可以在短期內(nèi)獲得大規(guī)模苗木，滿足市場需求，是木本植物快速、高效無性繁殖的主要方式。影響植物組織培養(yǎng)的因素較多，如基因型、取材時間、消毒時間、培養(yǎng)基、激素等。外植體消毒時間太短，外植體消毒不干凈，污染率高；消毒時間太長，污染率低，但對外植體殺傷力大，褐化嚴重。本研究結(jié)果表明，華木蓮半木質(zhì)化莖段組織培養(yǎng)消毒最佳時間為7min，褐化率低，存活率和萌芽率達到最大值，分別為31.25%和20.63%。

植物組織培養(yǎng)采用較多的基本培養(yǎng)基是MS、White、DCR 等培養(yǎng)基，根據(jù)研究目的的不同進行調(diào)整。吳金壽[3]等研究表明，樟樹莖段接入不同培養(yǎng)基培養(yǎng)，以改良MS 為基本培養(yǎng)基的組合誘導(dǎo)不定芽數(shù)量最多，苗況較好未見褐變；而以MS 為基本培養(yǎng)基的組合有褐變現(xiàn)象；以1/2MS 為基本培養(yǎng)基的組合不定芽誘導(dǎo)系數(shù)最低，且莖葉變?yōu)闂椉t色。吳幼媚[4]等在MS培養(yǎng)基中加入Ca（NO3）2，能夠較好地誘導(dǎo)初始芽的形成，減輕芽的褐化程度，促進芽正常生長。本研究結(jié)果表明，華木蓮莖段組織培養(yǎng)采用MS 培養(yǎng)基褐化率低于DCR 培養(yǎng)基，存活率、愈傷率和萌芽率高于DCR 培養(yǎng)基，且采用MS 培養(yǎng)基，莖段容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，腋芽萌芽也較快。因此，華木蓮莖段組織培養(yǎng)適宜基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基。

外源激素是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因子，在外植體的誘導(dǎo)、不定芽的分化與增值及芽苗生根培養(yǎng)過程中，外源激素發(fā)揮重要的作用。長期以來，對激素的研究一直停留在憑經(jīng)驗摸索的基礎(chǔ)上，對于同一植物，所用激素種類和濃度說法不一。BA、NAA 和IBA 是植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣的激素。辜夕容[5]等研究表明高濃度的6-BA 對香樟莖段上隱芽的萌動與伸長有利，而低濃度6-BA 有利于愈傷組織的生長；NAA 濃度越高，香樟莖段上愈傷組織長得越好，但過低或過高則不利于香樟莖段隱芽的萌動與伸長，NAA 為0.05mg/L時，腋芽才長得最好；同時6-BA 與NAA 的比值對香樟莖段上隱芽的萌動與伸長及愈傷組織的生長有較大影響，6-BA/NAA 為40 時，萌出的腋芽最長，較低配比則有利于促進愈傷組織的形成。本研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)華木蓮莖段腋芽萌芽的適宜激素配比MS+1.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L IBA，腋芽萌芽較快，芽粗壯，葉片舒展，切口有較多愈傷組織形成。華木蓮芽的繼代培養(yǎng)難以增殖，可能是因為華木蓮在遺傳存在嚴重退化，這與龍桂根等[6]、劉素梅等[7]研究一致。