李琰 李宇飛 丁恒一 劉濤 趙菊梅

(1南陽市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院普通外科，河南 南陽 473000；2延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室)

結(jié)腸癌屬于臨床常見消化道腫瘤，其發(fā)病率、死亡率占據(jù)所有惡性腫瘤的第三位，且近年來發(fā)病率逐漸升高〔1〕，盡管近年來手術(shù)、放化療治療取得一定的臨床效果，但部分患者5年生存率不高，約為50%，因此探究其病理機(jī)制，對(duì)于尋找該病的治療靶點(diǎn)，提高患者的預(yù)后十分重要〔2〕?？咕臑樯矬w產(chǎn)生抵抗外界病原的小分子多肽，可抵抗病毒、真菌等，其主要活性成分為防御素。研究顯示當(dāng)腫瘤細(xì)胞膜表面特性變化后能夠結(jié)合防御素，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤功效〔3〕。體外研究顯示小鼠β-防御素(mBD)2重組質(zhì)粒能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖〔4〕。mBD2是否能夠影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，目前尚未有報(bào)道。本研究通過體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞，并轉(zhuǎn)染mBD2重組質(zhì)粒，以期探究其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞與培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，于-80℃冰箱中保存，使用時(shí)置于37℃溶解后，1 000 r/min離心5 min棄去上清，添加含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2藥品與試劑 MTT、DMSO購于美國(guó)Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素與鏈霉素均購于美國(guó)Gibco公司；胰酶溶液購于杭州碧云天生物研究所；Lipofectamine 2000試劑盒購于廣州Invitrogen公司；鼠抗人Bcl-2、Bax、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司；鼠抗人β-actin抗體購美國(guó)CST公司；CCK8試劑盒、聚偏氟乙烯(PDVF)膜購于上海生工生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗購自美國(guó)R&D公司；蛋白提取試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Thermo公司；AnnexinV-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購自碧云天公司；電子熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；蛋白凝膠成像儀、酶標(biāo)儀購自Bio-Red公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞處理 取對(duì)數(shù)期培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整密度為5×105個(gè)/ml，制備單細(xì)胞懸浮液。構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mBD2，將細(xì)胞置于不含胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為3組，將轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mBD2分別轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，命名空白對(duì)照組(Control組)、陰性轉(zhuǎn)染組(NC組)、mBD2轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后置于37℃、5%CO2中培養(yǎng)48 h，隨后收集細(xì)胞上清，進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

1.3.2CKK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)孔中，細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)定空白孔僅添加胞培養(yǎng)液，均放置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，培養(yǎng)結(jié)束后加入CKK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，離心后保留下層細(xì)胞，每孔添加150 μl DMSO溶液，常溫孵育20 min，在酶標(biāo)儀中570 nm處測(cè)定溶液吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/空白組OD×100%。

1.3.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞分組后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，接種于含有蓋玻片6孔板內(nèi)，過夜后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上層細(xì)胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入10%甲醛溶液固定1 h，PBS清洗后，添加500 μl 1 μg/ml Hoechst33342 染液染色10 min，PBS沖洗后置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成數(shù)目 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，接種含37℃預(yù)溫培養(yǎng)皿內(nèi)，放置37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去上清液，PBS清洗后添加4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫下放置15 min，采用含0.1% Gimsa溶液染色30 min后，然后用流水緩慢洗去染色液，常溫下干燥，拍照后用肉眼直接計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)目。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù) 將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞中加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，用預(yù)冷PBS清洗2次后，加入70%乙醇溶液固定過夜，PBS清洗細(xì)胞后加入FITC-AV，避光下孵育20 min，與細(xì)胞流式儀中檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，添加200 μl PBS于75%乙醇冰上固定30 min。將細(xì)胞用0.05 mg/ml PI和0.5 mg/ml的RNA酶A孵育30 min后，置于流式細(xì)胞儀下檢測(cè)各時(shí)期DNA含量變化情況。

1.3.6Western印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染后48 h，采用蛋白提取試劑盒各組SW480細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白試劑盒對(duì)細(xì)胞中總蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離等量蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，置于4℃下添加一抗與β-actin(1∶500)孵育過夜。洗滌后添加辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)常溫下孵育2 h。采用Tanon600圖像分析系統(tǒng)對(duì)Bcl-2、Bax、活化型caspase-3蛋白水平進(jìn)行定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株鑒定 轉(zhuǎn)染48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480發(fā)出綠色熒光，其轉(zhuǎn)染效率為85.39%以上，見圖1。

2.2CKK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，mBD2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，在同一時(shí)間點(diǎn)，與Control、NC組相比，mBD2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞抑制率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 Hoechst染色顯示，Control、NC組細(xì)胞形態(tài)、大小均正常，mBD2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光強(qiáng)度增高，部分細(xì)胞出現(xiàn)碎片化。見圖2。

2.4細(xì)胞克隆形成情況 與Control組〔(72.44±13.58)個(gè)〕、NC組〔(76.53±12.16)個(gè)〕相比，mBD2轉(zhuǎn)染組〔(34.27±4.78)個(gè)〕細(xì)胞克隆形成數(shù)目均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況(×200)

組別24 h48 h72 h96 hControl組6.36±0.876.49±0.796.93±0.887.01±0.71NC組6.57±0.926.66±0.896.75±1.026.89±0.84mBD2轉(zhuǎn)染組17.74±2.651)26.34±3.161)34.62±4.261)41.18±5.391)

與Control組、NC組比較：1)P<0.05，下表同

圖2 結(jié)腸癌細(xì)胞Hoechst染色(×100)

圖3 細(xì)胞克隆形成情況

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 與Control組〔(5.46±1.07)%〕、NC組〔(4.95±1.03)%〕相比，mBD2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率〔(81.63±13.26)%〕升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6細(xì)胞周期檢測(cè) 與Control、NC組相比，mBD2轉(zhuǎn)染組G1期DNA量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組G2期、S期DNA量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞周期變化

2.7細(xì)胞中Bax、Bcl-2、活化型caspase3蛋白表達(dá)情況 與Control、NC組相比，mBD2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bax、活化型caspase3蛋白表達(dá)均升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、活化型caspase3蛋白的表達(dá)

組別Bax/β-actinBcl-2/β-actin活化型caspase3/β-actinControl組0.23±0.030.93±0.170.36±0.04NC組0.25±0.040.88±0.040.39±0.05mBD2轉(zhuǎn)染組0.88±0.151)0.16±0.021)0.92±0.101)

3 討 論

結(jié)腸癌嚴(yán)重威脅人類健康，死亡率、發(fā)病率居高不下，因此尋找安全、高效的治療方法是目前的重要任務(wù)。臨床傳統(tǒng)治療主要以手術(shù)輔助放化療為主，但放化療副作用較大，患者難以忍受。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，結(jié)腸癌基因治療獲得良好的進(jìn)展，但安全問題及長(zhǎng)期療效仍有待解決。腫瘤疫苗近期在結(jié)腸癌治療中取得了突破性進(jìn)展，通過激活自身免疫系統(tǒng)增強(qiáng)機(jī)體抗癌能力，進(jìn)而抑制腫瘤的增殖，降低腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率〔5〕。防御素是產(chǎn)生免疫反應(yīng)時(shí)自身細(xì)胞分泌的，具有抵抗細(xì)胞毒性、微生物的小分子多肽，在受到外界刺激時(shí)可即刻產(chǎn)生抗微生物反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體以免受到外界病原微生物損害，在固有免疫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，目前廣泛用于抗病毒、抗菌研究。近期研究顯示防御素可通過裂解腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而抑制腫瘤的增殖，提示防御素可能為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)〔6〕。

在BD防御家族中，mBD1為主要表達(dá)，其在腎臟、呼吸道黏膜上皮細(xì)胞中均表達(dá)。而mBD2、mBD3、mBD4在外界LPS及炎癥因子如IL-1、IL-17等誘導(dǎo)下激活NF-kB通路而表達(dá)。mBD2主要于呼吸道黏膜上皮中表達(dá)〔7〕。Zhang等〔8〕研究顯示mBD2可使小鼠對(duì)腫瘤抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。在荷瘤模型小鼠中研究顯示mBD2能夠明顯抑制荷瘤小鼠腹水積累〔9〕。另外在宮頸癌中研究顯示其能夠抑制宮頸癌腫瘤的生長(zhǎng)，抑制率可達(dá)40%〔10〕。Ping等〔11〕通過構(gòu)建mBD2重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至CT26腫瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示BD2具有趨化DC的活性，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。本研究細(xì)胞轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定性較強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，表明mBD2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480具有一定的抑制作用。以往研究顯示mBD2可能通過影響腫瘤細(xì)胞呼吸，引發(fā)細(xì)胞代謝紊亂，進(jìn)而降低其活性〔12〕，但具體機(jī)制還有待深入研究。

腫瘤的發(fā)生屬于周期性疾病，腫瘤細(xì)胞周期失控是導(dǎo)致細(xì)胞過度繁殖或腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的主要原因。細(xì)胞周期主要由G1、S、G2期及分裂期M組成，其中G1期決定了細(xì)胞總周期的長(zhǎng)短。越來越多證據(jù)表明，通過調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)蛋白進(jìn)而對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞體外增殖活性〔13〕。李海星等〔14〕研究顯示對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)吳茱萸堿處理后能夠使細(xì)胞周期阻滯在G1期，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，表明通過調(diào)控結(jié)腸癌的細(xì)胞周期，能夠明確藥物對(duì)結(jié)腸癌增殖影響的機(jī)制，可為結(jié)腸癌的臨床治療提供一定的參考。本研究表明mBD2能夠使細(xì)胞周期阻滯在G1期，引起細(xì)胞周期阻滯，從而參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的周期進(jìn)展，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。

細(xì)胞凋亡時(shí)涉及一系列基因激活、表達(dá)，其中凋亡誘導(dǎo)因子和凋亡抑制因子占有重要作用〔15〕。caspase-3通路是機(jī)體正常發(fā)育過程中與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的決定性因素，能夠剪切凋亡過程較多關(guān)鍵蛋白進(jìn)而在細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用〔16〕。另外Bcl-2家族也與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，正常情況下，Bax與Bcl-2和Bcl-xl形成二聚體阻止細(xì)胞凋亡；受到誘導(dǎo)凋亡刺激時(shí)，Bax蛋白表達(dá)增加，從細(xì)胞質(zhì)中遷移至線粒體和核膜上，促使Bax-Bax二聚體在線粒體膜上形成，使線粒體膜通透性增加，使得凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、細(xì)胞色素C等凋亡因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase-3通路而誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔17〕。在前列腺癌中研究顯示防御素能夠誘導(dǎo)凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)升高，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用，表明防御素能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤的增殖〔18〕。本研究結(jié)果表明mBD2可能通過調(diào)控Bcl-2/Bax表達(dá)，促進(jìn)活化型caspase-3凋亡通路激活而實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡的誘導(dǎo)作用，提示推測(cè)mBD2可能作為治療結(jié)腸癌的生物靶標(biāo)。