王聚 蔣茂燕 楊培慶

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，貴州 遵義 563003)

甲狀腺癌起源于甲狀腺濾泡旁細胞或甲狀腺濾泡細胞，甲狀腺癌具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移快等特點，研究甲狀腺癌細胞生長、侵襲等生物學分子機制對甲狀腺癌的治療具有重要意義〔1，2〕。聚束蛋白(Fascin)-1是肌動蛋白結(jié)合蛋白，其具有促進肌動蛋白成束的作用，參與細胞骨架的調(diào)控過程，F(xiàn)ascin-1在內(nèi)皮細胞、間質(zhì)細胞、樹突細胞、神經(jīng)細胞中廣泛表達，在其他正常細胞中幾乎不表達〔3～5〕。研究顯示，F(xiàn)ascin-1在腫瘤組織中高表達，目前在食管癌、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤中已經(jīng)得以證實，腫瘤細胞敲低Fascin-1后，細胞凋亡增多，腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力下調(diào)〔6～8〕。Fascin-1在甲狀腺癌組織中表達上調(diào)，而對于其在甲狀腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學特性中的作用尚不明確〔9〕。本實驗探討敲低Fascin-1在甲狀腺癌細胞生物學特性中的作用，為研究Fascin-1在甲狀腺癌發(fā)生中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、-9抗體、活化的Caspase(C-Caspase)-9抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；Trizol細胞總RNA抽提試劑購自上海史瑞克生物科技有限公司；SYBR實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物合成；C-Caspase-3抗體、Fascin-1抗體購自美國Bioss；Fascin-1 shRNA重組慢病毒和陰性對照慢病毒購自山東維真生物科技有限公司；人甲狀腺癌細胞K1、GTHW3、FTC-133和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1購自美國ATCC。

1.2實時PCR檢測Fascin-1表達 收集人甲狀腺癌細胞K1、GTHW3、FTC-133和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，提取細胞中的總RNA，RNA溶解在無核糖核酸酶的超凈水中，以紫外分光光度計檢測A260和A280，A260和A280比值在1.8～2.0。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以SYBR熒光染料法進行qRT-PCR。反應結(jié)束后獲取各個反應的Ct值，根據(jù)2-△△Ct法對Fascin-1表達量進行分析，GAPDH作為參照。Fascin-1正義：5′-CTCCCTGCTAACCCCTTCTCC-3′，反義：5′-CCCAACCGTCCCTTAGCC-3′。GAPDH正義：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反義：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.3Western印跡檢測Fascin-1表達 收集人甲狀腺癌細胞K1、GTHW3、FTC-133和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，添加放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，迅速混合以后，放在冰上靜置20 min，把各組細胞收集以后，4℃離心20 min，吸取上清，經(jīng)二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度以后，在蛋白樣品中添加5×上樣緩沖液混合液，100℃煮沸5 min，放在冰箱內(nèi)備用。吸取50 μg的蛋白樣品，添加到上樣孔內(nèi)，電泳開始的電壓設(shè)置為80 V，溴酚藍要進入分離膠時調(diào)整電壓為100 V，電泳時間約3 h，此時溴酚藍跑出凝膠。在4℃，100 V恒壓條件下進行轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。把PVDF膜放在5%牛血清白蛋白中孵育2 h后，置于一抗雜交袋內(nèi)，一抗以1∶400稀釋，4℃過夜，再置于二抗雜交袋內(nèi)，二抗以1∶2 000稀釋，在室溫孵育2 h。電化學發(fā)光(ECL)顯色，顯影后，對蛋白條帶進行半定量分析，內(nèi)參為GAPDH。

1.4細胞分組和感染 K1細胞接種到6孔板內(nèi)，細胞接種密度為104個細胞/孔，細胞生長密度為30%～40%時，在細胞中添加慢病毒，感染復數(shù)(MOI)=20，培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達，轉(zhuǎn)染效率高于85%用于后續(xù)實驗。把感染Fascin-1 shRNA和陰性對照慢病毒的K1細胞記為Fascin-1 shRNA和shRNA-NC，把未做感染的細胞作為對照(Control)。用實時定量PCR和Western印跡檢測Fascin-1 shRNA干擾效果，步驟同1.2和1.3。

1.5MTT檢測細胞增殖 Control、shRNA-NC、Fascin-1 shRNA細胞接種到96孔板內(nèi)，每孔加3×103個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h以后，在每孔中添加20 μl的噻唑藍(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，把孔內(nèi)的液體棄掉，添加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，溶解10 min后，檢測490 nm的A值，經(jīng)空白孔調(diào)零以后，分析細胞存活率變化。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取Control、shRNA-NC、Fascin-1 shRNA細胞，在細胞中添加結(jié)合緩沖液約500 μl，添加5 μl的Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)，混勻后，再添加5 μl的碘化丙啶(PI)，置于室溫中避光反應5 min，在1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.7Transwell小室檢測細胞侵襲 取Control、shRNA-NC、Fascin-1 shRNA細胞，用24孔8 μm濾膜微孔Transwell小室進行細胞侵襲實驗，在小室內(nèi)添加基質(zhì)膠將小室濕化以后，在小室的上室每孔加入5×108個細胞(以不含血清的培養(yǎng)液稀釋)，下室內(nèi)加入1 000 μl的細胞培養(yǎng)液，常規(guī)方法培養(yǎng)24 h后，把小室表面的細胞擦掉，用結(jié)晶紫染色以后，顯微鏡下觀察細胞侵襲數(shù)目(×100)。

1.8劃痕愈合實驗檢測細胞遷移 取Control、shRNA-NC、Fascin-1 shRNA細胞，接種到24孔板內(nèi)，接種密度為每孔添加5×104個細胞，細胞匯合成片以后，在24孔板內(nèi)劃線，添加1%胎牛血清的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察0 h和24 h劃痕的寬度(×40)，計算細胞遷移距離(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)。

1.9Western印跡檢測細胞中MMP-2、-9、C-Caspase-3、-9蛋白水平 取Control、shRNA-NC、Fascin-1 shRNA細胞，步驟同1.3，其中MMP-2、-9抗體以1∶400稀釋，C-Caspase-3、-9抗體以1∶600稀釋。

1.10統(tǒng)計分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Fascin-1蛋白和mRNA在甲狀腺癌細胞中高表達 人甲狀腺癌細胞K1、GTHW3、FTC-133中Fascin-1蛋白和mRNA表達水平顯著高于人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1(P<0.05)。K1細胞中Fascin-1蛋白和mRNA表達水平顯著高于GTHW3、FTC-133細胞(P<0.05)。見圖1和表1。選用表達水平較高的K1細胞做后續(xù)實驗。

2.2Fascin-1 shRNA對甲狀腺癌細胞中Fascin-1 mRNA和蛋白表達影響 Fascin-1 shRNA重組慢病毒感染后的甲狀腺癌細胞中Fascin-1 mRNA和蛋白表達水平較其他兩組顯著降低(P<0.05)。Fascin-1 shRNA能夠成功下調(diào)甲狀腺癌細胞中Fascin-1 mRNA和蛋白的表達。見圖2和表2。

圖1 人甲狀腺癌細胞K1、GTHW3、FTC-133和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1中Fascin-1蛋白水平

細胞Fascin-1 mRNAFascin-1蛋白K14.15±0.361)0.32±0.041)GTHW33.01±0.231)2)0.16±0.021)2)FTC-1333.56±0.141)2)0.22±0.021)2)Nthy-ori 3-11.00±0.000.03±0.01F/P值111.165/0.00070.520/0.000

與Nthy-ori 3-1比較：1)P<0.05；與K1比較：2)P<0.05

圖2 Western印跡測定Fascin-1 shRNA對甲狀腺癌細胞中Fascin-1蛋白表達影響

表2 慢病毒感染后甲狀腺癌細胞中Fascin-1 mRNA和蛋白表達水平

與shRNA-NC、Control比較：1)P<0.05;下表同

2.3敲低Fascin-1抑制甲狀腺癌細胞增殖并誘導凋亡 敲低Fascin-1后的甲狀腺癌細胞的存活率顯著較其他兩組降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，敲低Fascin-1抑制甲狀腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。見圖3，表3。

2.4敲低Fascin-1降低甲狀腺癌細胞侵襲和遷移能力 敲低Fascin-1后甲狀腺癌細胞侵襲數(shù)目和遷移距離均較其他兩組顯著降低(P<0.05)，敲低Fascin-1抑制甲狀腺癌細胞侵襲和遷移能力。見表4。

圖3 流式細胞術(shù)測定敲低Fascin-1對甲狀腺癌細胞凋亡的影響

表3 敲低Fascin-1后甲狀腺癌細胞存活率和凋亡率比較

表4 敲低Fascin-1后甲狀腺癌細胞侵襲數(shù)目和遷移距離比較

2.5敲低Fascin-1對甲狀腺癌細胞中MMP-2、-9蛋白、C-Caspase-3、-9蛋白表達影響 敲低Fascin-1后的甲狀腺癌細胞中MMP-2、-9蛋白水平較其他兩組顯著降低，C-Caspase-3、-9蛋白水平較其他兩組顯著升高，敲低Fascin-1抑制甲狀腺癌細胞中MMP-2、-9蛋白表達，提高細胞中C-Caspase-3、-9蛋白水平。見表5和圖4。

表5 敲低Fascin-1后甲狀腺癌細胞中MMP-2、-9、C-Caspase-3、-9蛋白水平比較

圖4 Western印跡檢測敲低Fascin-1后甲狀腺癌細胞中MMP-2、-9、C-Caspase-3、-9蛋白水平

3 討 論

Fascin是從海膽卵母細胞中分離出來的一種結(jié)合蛋白，其可以與肌動蛋白緊密連接形成束狀結(jié)構(gòu)，在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Fascin的3種形式，其中Fascin-1在神經(jīng)系統(tǒng)組織和間質(zhì)組織中表達，F(xiàn)ascin-2在視網(wǎng)膜細胞中廣泛表達，F(xiàn)ascin-3特異性表達于睪丸組織中，F(xiàn)ascin-1與腫瘤發(fā)生有關(guān)〔10～12〕。Fascin-1與肌動蛋白結(jié)合形成束狀結(jié)構(gòu)，并且Fascin-1定位于束狀結(jié)構(gòu)的核心部位，其可以促進細胞形成偽足樣結(jié)構(gòu)，促進細胞運動和遷移〔13〕。目前在卵巢癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Fascin-1高表達，敲低其表達不僅可以下調(diào)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力，還可以誘導腫瘤細胞凋亡〔14，15〕。本實驗結(jié)果表明，F(xiàn)ascin-1在甲狀腺癌細胞中表達水平高于正常甲狀腺細胞，并且敲低其表達后的甲狀腺癌細胞增殖、侵襲、遷移能力均降低，細胞凋亡增多，F(xiàn)ascin-1在甲狀腺癌細胞中高表達，敲低Fascin-1表達具有抗甲狀腺癌作用。

腫瘤細胞的凋亡與腫瘤細胞中Caspase凋亡反應有關(guān)，Caspase是一種廣泛存在于人類各種組織和器官中的天冬氨酸蛋白水解酶，其在內(nèi)皮細胞、上皮細胞、神經(jīng)細胞等細胞凋亡中均具有調(diào)控作用，細胞在受到凋亡信號刺激以后，細胞內(nèi)Caspase蛋白家族成員能夠迅速激活，誘導細胞凋亡〔16，17〕。Caspase-9和Caspase-3分別是Caspase凋亡反應的起始和執(zhí)行因子，正常情況下以沒有活性的酶原形式存在，只有被激活后才可以誘導細胞凋亡〔18，19〕。敲低Fascin-1具有激活細胞內(nèi)Caspase級聯(lián)反應的作用〔20〕。本實驗表明，敲低Fascin-1具有激活Caspase級聯(lián)反應誘導甲狀腺癌細胞凋亡的作用。

腫瘤細胞的侵襲和遷移過程是一個多步驟過程，細胞外基質(zhì)降解是細胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一，腫瘤細胞分泌的MMPs是細胞降解外基質(zhì)的主要蛋白酶，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中與腫瘤關(guān)系最密切的成員，二者幾乎可以降解細胞外基質(zhì)的所有成分，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進作用〔21～23〕。在胰腺癌、膽管癌等腫瘤細胞中的研究表明，敲低Fascin-1具有下調(diào)腫瘤細胞中MMPs表達水平的作用〔24，25〕。本研究提示敲低Fascin-1通過抑制甲狀腺癌細胞合成MMP-2、-9降低細胞的侵襲和遷移能力。

綜上，F(xiàn)ascin-1在甲狀腺癌細胞中高表達，敲低Fascin-1具有抑制甲狀腺癌細胞增殖、侵襲、遷移并誘導甲狀腺癌細胞凋亡的作用，F(xiàn)ascin-1在甲狀腺癌發(fā)生中可能發(fā)揮促進作用，靶向Fascin-1可能是治療甲狀腺癌的途徑之一。