趙斌 劉亞斌 王光林

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院普外二科，河北 衡水 053000)

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高，是影響其預(yù)后的重要因素〔1〕。平滑肌(SM)22α是一種細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞外基質(zhì)降解〔2〕，并在惡性腫瘤組織如肺癌、前列腺癌和乳腺癌等表達(dá)下調(diào)。本研究旨在檢測(cè)SM22α在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，并分析與肝臟轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，進(jìn)一步探討其在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本采集 63例結(jié)直腸癌腫瘤組織及癌旁組織(距腫瘤組織10 cm以外正常腸管黏膜組織)，其中9例肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤組織，取材自河北醫(yī)科大學(xué)附屬哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院普外科2017年1月至2018年6月患者術(shù)中，標(biāo)本提取組織蛋白或使用4%多聚甲醛固定24 h后通過石蠟包埋制作石蠟包塊。

1.2試劑 兔抗人SM22α多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(ab14106)，兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司(13667)，免疫組織化學(xué)SP染色試劑盒二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3Western印跡法 術(shù)中切除組織使用生理鹽水沖洗，置于加有RIPA蛋白裂解液的研磨器中充分研磨，冰上靜置后離心，吸取上清液并進(jìn)行蛋白定量。加入6×上樣緩沖液(1∶5體積比)并煮沸5 min，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，一抗孵育過夜后置于相應(yīng)二抗處理，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液進(jìn)行蛋白顯影，目的蛋白與內(nèi)參蛋白標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對(duì)比值。

1.4免疫組織化學(xué)染色 石蠟包塊連續(xù)切片，組織染色采用SP法，組織切片60℃烤片4 h，二甲苯脫蠟、乙醇水化及蒸餾水洗滌，121℃高壓抗原修復(fù)5 min，0.3%過氧化氫處理30 min，一抗孵育過夜，復(fù)溫后滴加二抗處理1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗并滴加DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染并脫水、透明和封片處理，置于顯微鏡下觀察。每張免疫組化選取5個(gè)視野拍照，染色棕黃色表示陽(yáng)性，統(tǒng)計(jì)300個(gè)腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例判斷表達(dá)水平：其中陰性(-)≤5%和陽(yáng)性(+)>5%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)直腸癌組織及癌旁組織SM22α表達(dá) 結(jié)直腸癌組織中共有15例(23.8%)染色陽(yáng)性，癌旁組織中共有57例(90.5%)染色陽(yáng)性，與癌旁組織相比，SM22α在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率顯著降低〔(86.61±4.37)% vs (21.53±3.49)%,P<0.01〕。見圖1。結(jié)直腸癌組織中SM22α蛋白表達(dá)較癌旁組織顯著減弱(0.73±0.13 vs 1.41±0.32,P<0.05)。見圖2。

2.2結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移組織與結(jié)直腸癌原位組織SM22α表達(dá)比較 結(jié)直腸癌組織中共有15例(23.8%)染色陽(yáng)性，在肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中共有1例(11.1%)染色陽(yáng)性，與結(jié)直腸癌組織相比，SM22α在肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性率顯著降低〔(21.53±3.49)% vs (10.28±1.54)%,P<0.05〕。見圖3。結(jié)直腸癌組織中SM22α蛋白表達(dá)顯著高于肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織(0.73±0.13 vs 0.62±0.09,P<0.05)。見圖4。

圖1 免疫組化檢測(cè)SM22α在結(jié)直腸癌及癌旁組織表達(dá)(×400)

圖3 免疫組化檢測(cè)SM22α在結(jié)直腸癌及肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織表達(dá)(×400)

圖4 Western印跡檢測(cè)SM22α在結(jié)直腸癌及肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中表達(dá)

2.3結(jié)直腸癌組織SM22α和MMP-9相關(guān)性分析 63例結(jié)直腸癌及9例肝臟轉(zhuǎn)移組織中SM22α和MMP-9表達(dá)均陽(yáng)性者為6例，均陰性者7例；SM22α表達(dá)陽(yáng)性，MMP-9表達(dá)陰性者10例；SM22α表達(dá)陰性，MMP-9表達(dá)陽(yáng)性者49例。SM22α和MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.489，P<0.01)。

3 討 論

結(jié)直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，主要依賴根治性手術(shù)切除術(shù)進(jìn)行治療，而患者常常發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而影響生存率〔3〕。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征之一，是多步驟、復(fù)雜的連續(xù)性過程〔4〕，主要包括：與基膜和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附、降解和穿透、移行和定植。結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移主要器官是肝臟，約50%的患者會(huì)發(fā)生術(shù)前或術(shù)后肝臟轉(zhuǎn)移，約有30%的患者在手術(shù)前已有B超或CT無法檢測(cè)的隱匿性肝轉(zhuǎn)移〔5〕。了解結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制，尋找相應(yīng)阻斷途徑對(duì)結(jié)直腸癌治療有重要指導(dǎo)作用。既往研究證實(shí)結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程受到轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移抑制基因、細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤的血管生成及腫瘤微環(huán)境等因素影響〔6〕，本研究重點(diǎn)探討SM22α與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

SM22α是重要的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，在SM細(xì)胞中大量表達(dá)，具有調(diào)節(jié)肌肉收縮性、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、組織入侵和抑制腫瘤等功能〔7〕，研究發(fā)現(xiàn)SM22α在肺癌〔8〕、結(jié)直腸癌〔7〕和乳腺癌〔9〕等組織中表達(dá)下調(diào)，此外SM22α高表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡〔10〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SM22α在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)低于癌旁組織，提示SM22α與腫瘤發(fā)生可能存在聯(lián)系。此外研究發(fā)現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中SM22α表達(dá)低于結(jié)直腸癌原位組織，說明SM22α可能與結(jié)直腸癌發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。既往報(bào)道發(fā)現(xiàn)SM22α通過負(fù)性調(diào)控MMP-9的表達(dá)減弱細(xì)胞侵襲能力〔11〕，本研究結(jié)果顯示SM22α和MMP-9在蛋白水平存在負(fù)相關(guān)性，因此推測(cè)SM22α可能通過下調(diào)MMP-9蛋白水平調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，SM22α在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，肝臟轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)低于原位癌組織，SM22α與MMP-9存在負(fù)相關(guān)性，因此進(jìn)一步體外探究SM22α調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力是下一步工作重點(diǎn)，為結(jié)直腸癌的防治研究和抗癌藥物的研發(fā)提供新思路。