李大剛 楊熠 劉海燕 羅濱

(暨南大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院 深圳市人民醫(yī)院 1心臟大血管外科，廣東 深圳 518020；2婦科；3深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院心血管外科)

隨著人口老齡化的加劇及動脈粥樣硬化發(fā)病率的增高，心臟瓣膜病的發(fā)病率在逐年增加，其中老年退行性主動脈瓣病變在心臟瓣膜病變中占據(jù)了較大的比例〔1，2〕。主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞是心臟主動脈瓣膜中含量最為豐富的細(xì)胞，具有保持瓣膜正常結(jié)構(gòu)和功能的重要作用〔3〕。瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡和鈣結(jié)節(jié)形成參與了瓣膜退行性病變和鈣化形成。其生物學(xué)功能的改變對主動脈瓣膜病變的發(fā)生起重要作用〔4〕。雷洛昔芬(RAL)屬于第二代選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，最初主要用于女性絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松和乳腺癌的治療，后來在心血管方面研究發(fā)現(xiàn)，RAL 和其他一些SERM 均具有改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，擴(kuò)張冠狀動脈，調(diào)節(jié)血脂等功能，并且對動脈粥樣硬化和靜脈血栓形成等疾病亦具有保護(hù)作用〔5，6〕。RAL通過雌激素效應(yīng)元件(ERE)或其他途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而保護(hù)血管內(nèi)皮功能〔7，8〕。本研究通過對高糖高脂飲食的小鼠給不同濃度的RAL 3個月，檢測RAL對主動脈瓣脂肪化和鈣化的影響及相關(guān)凋亡基因的作用。

1 材料和方法

1.1動物 共50只雄性C57小鼠(10周齡)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。動物飼養(yǎng)在深圳市人民醫(yī)院無特定病源動物房。深圳人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會同意本研究所有實(shí)驗(yàn)。

1.2RAL給藥實(shí)驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。對照組(普通飼料喂養(yǎng))、高糖高脂組(高糖高脂飲食)、RAL低劑量組(RAL 4.5 mg/kg+高糖高脂飲食)、RAL中劑量組(RAL 9.0 mg/kg+高糖高脂飲食)、RAL高劑量組(RAL 18.0 mg/kg+高糖高脂飲食)。每天灌胃給藥共3個月，實(shí)驗(yàn)期間每天觀察動物飲食活動情況。

1.3實(shí)時定量PCR 給藥3個月后斷頸處死動物。實(shí)時定量PCR(RT-qPCR)檢測含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的相對表達(dá)水平。解剖取主動脈瓣組織提取總RNA用TRIzol 試劑盒(Invitrogen，USA)。RNA的濃度和純度用紫外分光光度計檢測其在260和280 nm的吸光度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(寶生物工程有限公司)完成，每反應(yīng)10 μl總體系。RT-qPCR用預(yù)混液試劑盒(寶生物工程有限公司)完成，每反應(yīng)20 μl體系。PCR擴(kuò)增用一步法定量PCR系統(tǒng)完成(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)，Caspase-3的相對表達(dá)水平參照標(biāo)準(zhǔn)化的β-actin內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt表示，并評估樣本間差異。上述各試劑盒操作根據(jù)供應(yīng)商操作說明。Caspase-3：正義鏈5′-TGTCATCTCGCTCTGGTACG-3′，反義鏈5′-CCCTTTCTGCCTGTCTTCTG -3′；GDPDH：正義鏈5′-ACCTCAACTACATGGTCTAC-3′，反義鏈5′-TTGTCATTGAGAGCAATGCC-3′。

1.4組織學(xué)檢測 給藥3個月后斷頸處死動物。取心臟主動脈瓣組織，在4%的甲醛緩沖液固定24 h，用逐級乙醇和二甲苯充分脫水與透明，56～58℃石蠟包埋，組織切片厚5 μm，脫蠟至水。用蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(南京建成生物科技有限公司)染色。茜素紅染色：觀察主動脈瓣組織鈣鹽沉積情況。茜素紅染色步驟為切片脫蠟至水后自來水洗2 min，0.1 %茜素紅染色30 min，甘油明膠封片。免疫組化染色：切片脫蠟至水后，3%過氧化氫(H2O2)溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓或酶消化修復(fù)抗原，加入Caspase-3抗體(1∶40)室溫孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。滴加50 μl即用型快捷免疫組化試劑，室溫下孵育10 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。結(jié)果用Image Proplus6.0(IPP6.0)專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像定量分析，計算各組的IOD值。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1組織學(xué)分析 HE染色發(fā)現(xiàn)高糖高脂組小鼠主動脈瓣組織出現(xiàn)了大量脂肪化區(qū)域，給不同濃度的RAL后主動脈瓣脂肪化得到了不同程度的改善，尤其是RAL高劑量組發(fā)現(xiàn)很少脂肪化區(qū)域。見圖1。茜素紅染色發(fā)現(xiàn)高糖高脂組小鼠主動脈瓣組織出現(xiàn)了大量點(diǎn)狀紅色鈣鹽沉積區(qū)域，但是在不同濃度RAL藥物組這種點(diǎn)狀紅色鈣鹽沉積點(diǎn)明顯減少了，尤其RAL高劑量組基本沒有呈現(xiàn)這種鈣化點(diǎn)。見圖2。免疫組化發(fā)現(xiàn)高糖高脂組小鼠主動脈瓣標(biāo)本切片有大量的棕黃色Caspase-3蛋白陽性表達(dá)，同時陽性表達(dá)區(qū)域定量分析也發(fā)現(xiàn)高脂高糖組明顯高于RAL低、中、高劑量組及對照組(P<0.05,P<0.01)，且RAL高劑量組極少觀察到陽性表達(dá)。見圖3、表1。

圖1 不同濃度的RAL對高糖高脂飲食小鼠心臟瓣膜影響(HE染色，×200)

圖2 不同濃度的RAL對高糖高脂飲食小鼠心臟瓣膜影響(茜素紅染色，×200)

圖3 不同濃度的RAL對高糖高脂飲食小鼠心臟瓣膜Caspase-3蛋白表達(dá)的影響(免疫組化染色，×200)

2.2RT-QPCR檢測Caspase-3 mRNA相對表達(dá)水平 RAL低、中、高劑量組及對照組小鼠主動脈瓣組織中Caspase-3 mRNA表達(dá)均顯著低于高糖高脂組(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)比較

與高糖高脂組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

3 討 論

心臟瓣膜病是危害人類健康的重要疾病，隨著年齡的增長退行性變性導(dǎo)致的主動脈瓣膜病變在心臟瓣膜病變中占主導(dǎo)地位，是導(dǎo)致主動脈瓣病變和接受主動脈瓣置換手術(shù)的最常見的原因〔9，10〕。主動脈瓣病變是一個復(fù)雜的病理過程，過去主動脈瓣膜的病變被普遍認(rèn)為是一種長期機(jī)械壓力誘導(dǎo)下的被動的、非調(diào)控的過程。目前，由于對主動脈瓣膜病變的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制缺乏了解，對于早期瓣膜病變?nèi)狈τ行У母深A(yù)手段。瓣膜的鈣化是該病主要病理癥狀，是受到活躍調(diào)控的主動的生物學(xué)過程〔11〕，這個復(fù)雜的調(diào)控過程中，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖和凋亡參與瓣膜病變和鈣化形成〔12，13〕。研究表明，高脂飲食可誘導(dǎo)新西蘭大白兔的瓣膜出現(xiàn)病變，而在病變的瓣膜中細(xì)胞凋亡的數(shù)目明顯增加〔14〕。

RAL在心血管疾病方面有治療作用〔15〕，可改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能〔16，17〕，擴(kuò)張冠狀動脈，調(diào)節(jié)血脂〔18〕，并且對動脈粥樣硬化和靜脈血栓形成有保護(hù)作用〔19，20〕。RAL通過抑制主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，對腎功能不全所致的瓣膜鈣化具有改善作用〔21〕。

長期高脂高糖飲食是心臟脂肪化的主要原因，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純高糖高脂飲食小鼠主動脈瓣組織出現(xiàn)了大量脂肪化區(qū)域，給不同濃度的RAL后主動脈瓣脂肪化得到了不同程度的改善。鈣化程度分析發(fā)現(xiàn)高糖高脂飲食小鼠主動脈瓣組織出現(xiàn)了大量點(diǎn)狀紅色鈣鹽沉積區(qū)域，但是在不同濃度RAL藥物組這種點(diǎn)狀紅色鈣鹽沉積點(diǎn)明顯減少了，尤其高濃度RAL組基本沒有呈現(xiàn)這種鈣化點(diǎn)。調(diào)控主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞凋亡的蛋白表達(dá)定量分析發(fā)現(xiàn)在給RAL后其表達(dá)也得到了一定程度的抑制。

綜上所述，本研究通過建立高糖高脂飲食小鼠主動脈瓣膜退行性病變模型，觀察不同濃度的RAL對主動脈瓣膜生物學(xué)功能的影響。發(fā)現(xiàn)合適的濃度RAL對主動脈瓣膜病變有一定的抑制作用，從而為RAL防治主動脈瓣膜疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。