蘆銀香，范曉丹，胡宗玉，吳 靜

（天津城建大學(xué)a.環(huán)境與市政工程學(xué)院；b.天津市水質(zhì)科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，天津300384）

我國是染料生產(chǎn)大國，且居于世界首位[1].據(jù)統(tǒng)計合成染料在生產(chǎn)和使用過程中大約有10%～20%染料釋放到水中，且每排放1 t 染料廢水，就會污染20 t 水體[2].根據(jù)染料所含的共軛體系結(jié)構(gòu)可分為偶氮染料、蒽醌染料及三苯甲烷類染料等，其中蒽醌染料是僅次于偶氮染料的第二大類染料[3-4].蒽醌類染料分子結(jié)構(gòu)中含蒽醌基，它具有色澤鮮艷、耐光度好及穩(wěn)定性好等優(yōu)點[5-6].蒽醌染料因色度大影響日光照射，不利于水生生物和植物的生長[7-8]；某些蒽醌染料能夠致癌、致畸、致突變[9]；因此，有效去除水體中蒽醌類染料是十分有必要的.

目前，國內(nèi)外針對印染廢水的處理方法可以分為物理法、化學(xué)法以及生物處理法.但物理、化學(xué)法因成本高、操作復(fù)雜及易產(chǎn)生二次污染等缺點，很大程度上限制了其發(fā)展[10].從污水處理廠的經(jīng)濟效益、生態(tài)適應(yīng)性和廣泛的適應(yīng)性的角度而言，生物處理法具有顯著的優(yōu)勢[11].處理染料廢水的生物包括細菌、真菌及藻類，細菌的處理效果優(yōu)于真菌和藻類[12-13]，越來越多的細菌被用于處理染料廢水[14-17].這些報道主要是關(guān)于偶氮染料廢水的處理，對于蒽醌染料廢水的研究相對少一些[18-20].

本研究從天津市某污水處理廠二沉池污泥中分離篩選出一株對蒽醌分散藍2BLN 具有較強脫色能力的菌株，經(jīng)16SrDNA 基因序列分析，鑒定為弗氏檸檬酸桿菌.探討影響菌種的生理學(xué)特征，獲得最適生長條件并研究其對蒽醌分散藍2BLN 的脫色性能.

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

污泥取自天津市某污水處理廠二沉池.模擬染料廢水的組成（g/L）：C6H6O61、（NH4）2S040.1、KH2PO40.03、MgSO40.2、CaCl20.01、FeCl30.01、NaCl 1 及染料（蒽醌分散藍2BLN）.

富集培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸膏5，氯化鈉10，pH=7.0～7.2.

LB 固體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸膏5，氯化鈉10，瓊脂粉20，pH=7.0～7.2.

分散藍2BLN、葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、氯化鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、三氯化鐵、重鉻酸鉀，硫酸亞鐵銨，上述藥品均為分析純.

1.2 儀器及設(shè)備

電子天平（FA2004N 型，上海菁海儀器有限公司）；全溫振蕩培養(yǎng)箱（ZWYR-200D 型，上海智城分析儀器制造有限公司）；紫外可見分光光度計（T6 新世紀型，北京普析通用儀器有限公司）；微波消解裝置（WMX-Ⅲ-B 型，韶關(guān)市明天環(huán)保儀器有限公司）；高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；超凈工作臺（SWCJ-1F 型，蘇州凈化設(shè)備有限公司）.

1.3 菌種的馴化、分離、純化、篩選

將配制好的廢水和污泥放置錐形瓶內(nèi)，置于溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的振蕩箱內(nèi)進行培養(yǎng).首次加入染料廢水濃度為5 mg·L-1，采用梯度馴化，直到各個濃度的色度及COD 去除效果趨于穩(wěn)定，馴化完成.用梯度稀釋、涂布平板的方法對馴化后的活性污泥中菌種反復(fù)分離純化，得到兩株細菌，命名為H1 和H2，通過比較它們的脫色率及COD 去除率，篩選出一株優(yōu)勢菌種.

1.4 高效脫色菌種的鑒定

對高效菌種（H2）的16SrDNA 的擴增片段進行測序與分析（委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行）：使用細菌基因組DNA 小量純化試劑盒提取基因組DNA.細菌16SrDNA 基因的引物序列為引物27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；引物1492R：5’-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3’.反應(yīng)體系包括反應(yīng)緩沖液15 μL，Taq 酶1 μL，DNTP10 μL,模板DNA1 μL，27 引物1 μL,1492R 引物1 μL，最后用去離子水補充至50 μL.PCR 反應(yīng)條件為96 ℃預(yù)變性3 min；96 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35 個循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min.PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.將獲得的16SrDNA 序列通過BLAST 程序與GenBank 中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，選取12 株序列相似性高的標準菌株，用Neighbor Joining（NJ）建樹方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 菌種生理學(xué)特征

用△OD600表征菌種凈生長量.將培養(yǎng)好的種子液按10%（v/v）的接種量接種模擬染料廢水中（染料濃度為40 mg·L-1），在搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1下，研究不同溫度（20，25，30，35，40 ℃）對菌種生長的影響；在最適溫度下，研究轉(zhuǎn)速（0，50，100，150，200 r·min-1）對菌種生長的影響；在最適溫度、轉(zhuǎn)速下，研究接種量（1%，5%，10%，15%，20%）對菌種生長的影響；在最適接種量、溫度、轉(zhuǎn)速下，研究不同pH（2，4，6，7，8，10，11）對菌種生長的影響；每隔1.5 h 取樣測OD600.

1.6 脫色率和COD 去除率

將處理前后的水樣在轉(zhuǎn)速為10 000 rpm/min 下離心10 min，取上清液，在最大波長625 nm 處測出吸光度.根據(jù)廢水降解前、后吸光度的變化計算出脫色率.脫色率計算公式如下式

式中：A0為進水吸光度值；At為t 時刻出水吸光度值.

采用重鉻酸鉀法測定COD，COD 去除率計算公式為

式中：COD0為進水COD 值，CODt為t 時刻出水COD 值.

1.7 紫外-可見光譜分析

將處理前后的水樣在轉(zhuǎn)速為10 000 rpm/min 下離心10 min，取上清液稀釋5 倍于300～700 nm 處進行紫外-可見波譜分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 高效菌種篩選

菌株H1、H2 對蒽醌分散藍（40 mg·L-1）隨時間變化的脫色率及COD 去除率如圖1 所示：8 d 后，H1、H2的脫色率分別為65.4%、79.14%；H1、H2 的COD 去除率分別57.97%、86.08%；H2 的脫色率及COD 去除率均高于H1.因此，本實驗選擇H2 為目標菌株.

圖1 H1 和H2 的脫色率及COD 去除率

2.2 H2 的鑒定

純化后的H2 菌株在LB 固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h 后，形成直徑為2～4 mm 的單菌落.H2 菌株的菌落（見圖2a）特征為圓形、表面有光澤、乳白色、不透明、易挑起，該菌為革蘭氏陰性菌，桿狀；16SrDNA 序列通過BLAST 程序與GenBank 中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，選取12 株序列相似性高的標準菌株，用Neighbor Joining（NJ）建樹方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2b）；生工生物工程（上海）股份有限公司給出的菌株鑒定結(jié)果報告（見圖2c）；綜上所述，H2 鑒定為弗氏檸檬酸桿菌.

圖2 菌株鑒定結(jié)果

2.3 弗氏檸檬酸桿菌（H2）生理學(xué)特征

2.3.1 生長溫度范圍及最適值

溫度對弗氏檸檬酸桿菌影響結(jié)果如圖3a 所示.由圖可知，在20 ℃和25 ℃時，該菌株基本上不能生長，這是因為低溫抑制了酶的活性；在30 ℃到40 ℃，菌種均能較好的生長，但△OD600從0.647 4 降至0.432 4，這是因為隨著溫度的升高，雖然酶促反應(yīng)加快，但酶活性喪失也加速；溫度變化既可以引起菌體細胞壁表面發(fā)生物理變化，也可影響分泌酶系的活性和穩(wěn)定性[21].因此，溫度對弗氏檸檬酸桿菌生長影響較大，且最適生長溫度為30 ℃.

2.3.2 生長轉(zhuǎn)速范圍及最適値

通過改變培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)錐形瓶內(nèi)的含氧量.轉(zhuǎn)速對弗氏檸檬酸桿菌影響結(jié)果如圖3b 所示.由圖可知，隨著轉(zhuǎn)速（0 r·min-1～200 r·min-1）的增大，該菌株生長趨勢呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢.當(dāng)轉(zhuǎn)速為0～150 r·min-1時，隨著轉(zhuǎn)速的增大，菌體生長的越好，這是因為較高轉(zhuǎn)速可為其提供足夠氧氣去維持該菌株的新陳代謝，說明該細菌是兼性好氧菌；但轉(zhuǎn)速為200 r·min-1時，該菌體生長趨勢反而有所下降，這是因為高轉(zhuǎn)速影響其機械強度，進一步影響了該菌體的生長.因此，弗氏檸檬酸桿菌最適轉(zhuǎn)速為150 r·min-1.

2.3.3 生長接種量范圍及最適値

接種量對弗氏檸檬酸桿菌影響結(jié)果如圖3c 所示：由圖可知，當(dāng)接種量為15%時，該菌株凈生長量最大，且9 h 時△OD600 為0.585 8；在前3 h，接種量越大（1%～20%），菌株生長越快，但之后20%生長趨勢不如15%.這是因為一開始接種量為20%的反應(yīng)器內(nèi)，微生物數(shù)量最多，繁殖最快，隨著時間越來越長，營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，微生物進入了穩(wěn)定期和衰老期.因此，弗氏檸檬酸桿菌最適接種量為15%.

2.3.4 生長pH 范圍及最適値

pH 對弗氏檸檬酸桿菌影響結(jié)果如圖3d 所示：由圖可知，在pH = 2 時，該菌株基本上不能生長，這說明該菌株不能在強酸環(huán)境生長；在當(dāng)pH = 4～7 時，隨著pH 增大，該菌株△OD600越大，這說明該菌株能在弱酸環(huán)境下生長，且在中性環(huán)境下生長的最好；當(dāng)pH = 8～11 時，△OD600越來越小，這說明該菌株能在弱堿性下生長，但強堿抑制其生長，且pH=11時，基本上不能生長.綜上所述，過酸或過堿均會引起微生物細胞表面特性與酶構(gòu)象的變化，進而影響微生物的生長和代謝[22].因此，弗氏檸檬酸桿菌最適pH=7.

圖3 菌株最適生長條件

2.4 紫外-可見波譜分析

反應(yīng)前后的水樣紫外-可見波譜分析結(jié)果如圖4所示.在最適生長條件下，反應(yīng)8 d 后分散藍2BLN 在波長584 nm 和620 nm 處的特征吸收峰逐漸減弱，最終基本消失，這與反應(yīng)液的顏色由藍色漸變?yōu)闊o色相一致，且此時脫色率為86.10%.由此推斷分散藍2BLN的蒽醌環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)色基團發(fā)生明顯變化.當(dāng)細菌以生物吸附的方式進行脫色時，所有吸收峰的吸光值將出現(xiàn)等比例的下降；當(dāng)以生物降解的方式進行脫色時，上清液在可見光區(qū)的吸收峰將完全消失，或者出現(xiàn)新的吸收峰[23].因此，弗氏檸檬酸桿菌對蒽醌分散藍2BLN 的脫色是通過生物降解的方式來實現(xiàn)的.

3 結(jié) 論

圖4 紫外-可見波譜分析

（1）從一般的市政活性污泥中分離到一株具有高效脫色分散藍2BLN 的菌株.經(jīng)16SrDNA 鑒定，該菌株為弗氏檸檬酸桿菌，屬于枸櫞酸桿菌屬.

（2）弗氏檸檬酸桿菌最適生條件：溫度為30 ℃，培養(yǎng)箱振蕩頻率為150 r·min-1，pH=7.8 d 后，分散藍2BLN（40 mg·L-1）脫色率達86.10%.

（3）弗氏檸檬酸桿菌對蒽醌分散藍2BLN 的脫色是通過生物降解的方式且分散藍2BLN 的蒽醌環(huán)被破壞.

（4）綜上所述弗氏檸檬酸桿菌是一株高效蒽醌染脫色菌，具有處理蒽醌染料廢水的開發(fā)潛能.